百子莲愈伤胚培养技术方法

5.1.3.1　p TCK303质粒转化大肠杆菌

（1）取出制备好的大肠杆菌DH-5α感受态细胞于冰上化冻后，加入质粒DNA 1μL（10-100 ng），轻轻混匀后冰上放置30 min；

（2）移至42℃水浴中热激90 s，再迅速放回冰上冷却1～2 min；

（3）加入800μL不含抗生素的LB液体培养基于37℃震荡培养45 min；

（4）复苏后的菌液4 000 g离心5 min，弃掉800μL上清液；

（5）用枪头小心吹打混匀剩余的200μL菌液，将菌液涂布于含100 mg/L卡纳霉素的筛选平板上，37℃倒置培养；

（6）从平板上挑取阳性单克隆菌落进行鉴定和保存。

5.1.3.2　p TCK303质粒DNA的提取

溶液Ⅰ：Tris-HCl 50 mmol/L（p H7.5），EDTA（p H8.0）10 mmol/L。

溶液Ⅱ：NaOH 0.2 mol/L，SDS 1%（储备液：NaOH 0.4 mol/L，SDS 2%）。

溶液Ⅲ：KAc 1.32 mol/L（p H4.8），高压灭菌。

溶液Ⅰ和溶液Ⅲ在121℃灭菌后，存放于4℃冰箱使用。溶液Ⅱ先配制母液然后现用现配。

质粒DNA提取步骤：

（1）将阳性转化菌落接种到含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养16～18 h（180 r/min）；

（2）4℃，12 000 rpm离心30 s，收集菌体；

（3）加入200μL溶液I（含RNase A 100μg/m L），震荡使菌体均匀悬浮，室温放置5～10 min；

（4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻柔颠倒混匀，冰浴放置5 min；

（5）溶液澄清后加入200μL预冷溶液Ⅲ，颠倒混匀，冰上放置5 min左右；

（6）4℃，12 000 rpm离心15 min。取上清液移到另一管中，加入0.7倍体积异丙醇振荡混匀，室温放置5 min；

（7）12 000 r/min离心10 min，70%乙醇洗涤沉淀，空气中干燥2 min后溶于TE，-20℃保存。

5.1.3.3　质粒DNA检测

将质粒DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察DNA条带大小。

构建质粒DNA单酶切体系（见表5-1），37℃水浴中酶切2～4 h后加入2μL 10×Loading Buf fer停止反应。将酶切后产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测质粒DNA的各酶切位点。

表5-1　质粒DNA单酶切体系

5.1.3.4　RNAi载体构建

试验所用的RNAi干扰载体为p TCK303，其质粒结构图见图5-1。

图5-1　p TCK303质粒结构图

百子莲TIR 1基因的RNAi表达载体构建原理如图5-2所示。

图5-2　RNAi表达载体结构及构建原理

5.1.3.5　总RNA提取与cDNA第一链合成

（1）总RNA提取方法同4.1.4.1。

（2）c DNA第一链合成。

在进行c DNA合成反应前，将纯化后的RNA溶液与65℃水浴加热5 min后迅速置于冰中，减弱二级结构的影响，以提高逆转录的反应效率。在离心管中配制下述反应液（见表5-2），建立逆转录反应体系。

表5-2　第一链cDNA合成反应体系

（1）混合均匀，室温放置10 min后，移至42℃恒温水浴中反应1 h；

（2）反应结束后放置于冰中冷却2 min。

5.1.3.6　TIR 1基因cds片段克隆

根据TIR 1基因全长序列，应用Primer 5.0软件设计引物。扩增片段选择不含质粒酶切位点序列，且在Genbank中进行Blast对比只有同源靶基因的序列，最终选择目标片段扩增长度为149 bp（1 234-1 382）。依据图5-2所示的构建策略，以RiTs与RiTa为引物（见表5-3），为扩增产物两侧引入SpeⅠ，SacⅠ，KpnⅠ，Bam HⅠ酶切位点（酶切位点识别序列见表5-3，表5-4）。PCR扩增体系（见表5-5）。取PCR扩增产物30μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，特异性条带进行胶回收处理。回收条带进行p MD18-T载体链接，转化大肠杆菌测序，方法同4.1.4.6。

表5-3　TIR 1干扰序列引物列表

表5-4　限制性内切酶识别位点及反应条件

表5-5　TIR 1基因片段PCR扩增体系

5.1.3.7　TIR 1-cds片段正向连接(www.xing528.com)

用SacⅠ与SpeⅠ两个限制性内切酶对TIR 1-cds回收片段与载体p TCK303进行双酶切过夜，酶切体系见表5-6。

表5-6　TIR 1-cds片段与载体pTCK303的双酶切体系

将上述酶切产物按以下步骤进行纯化：

（1）加入与产物等体积的氯仿，剧烈震荡混匀，13 500 r/min离心10 min。

（2）取上清，加入1/10体积的3M Na Ac与2.5倍体积的无水乙醇，-20沉淀1 h，13 500 r/min离心5 min。

（3）加入30μL dd H 2 O溶解沉淀。

将纯化好的酶切产物按30∶1（DNA片段：载体）比例混合进行连接反应（见表5-7），16℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，涂板筛选单克隆菌株进行目标片段PCR检测（引物序列见表5-8 TIRs与TIRa）；在p TCK303载体多克隆位点（MCS）两侧设计上下游引物（见表5-8 303s与303a），进行质粒PCR检测，验证重组质粒中连接片段的长度。检测合格的菌液按照5.1.3.2方法提取质粒DNA。

表5-7　TIR 1-cds片段与载体pTCK303的连接体系

表5-8　TIR 1干扰载体构建PCR 检测引物列表

5.1.3.8　TIR 1-cds片段反向连接

将正向连接TIR 1-cds片段的p TCK303载体命名为p TCK303-sense。再进行TIR 1-cds片段反向连接。用KpnⅠ与Bam HⅠ两个限制性内切酶对TIR 1-cds回收片段与载体p TCK303-sense进行双酶切过夜，酶切体系如表5-9所示。

表5-9　TIR 1-cds片段与载体pTCK303-sense的双酶切体系

将上述酶切产物按5.1.3.7的方法进行纯化，将纯化好的酶切产物按30∶1（DNA片段：载体）比例混合进行连接反应（见表5-10），16℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂板筛选单克隆菌株进行菌液PCR与质粒PCR验证；按5.1.3.2方法提取质粒DNA，并利用SacⅠ内切酶对构建的质粒进行双酶切，检测连接片段的长度，载体构建正确的菌株送去测序。

表5-10　TIR 1-cds片段与载体p TCK303-sense的连接体系

将连有正、反向TIR 1-cds片段的p TCK303质粒标记为p TCK303-sense-intron-antisense，并存放于-20℃备用。

5.1.3.9　农杆菌感受态的制备

取-80℃保存的EHA105于含有50μg/m L链霉素的YEB平板划线（YEB配方见表5-11），28℃培养2天。挑单菌落接种于5 m L YEP液体培养基中（YEP配方见表5-12），28℃220 r/min震荡培养12～16 h。再取过夜培养的菌液1 m L接种于50 m L YEP液体培养基中，28℃震荡培养至OD600为0.5左右，将菌液转入1.5 m L的EP管中，4℃5 000 r/min离心5 min。搜集菌体，加入1 m L预冷的0.15 M NaCl溶液悬浮菌体，冰上放置20 min。4℃5 000 r/min离心5 min，去上清，将菌体悬浮于200μL预冷的200 m M CaCl2（含15%甘油）溶液中，液氮速冻，存于-80℃冰箱中备用。

表5-11　YEB培养基配方

表5-12　YEP培养基配方

∗固体培养基中添加。

5.1.3.10　表达载体冻融法转化农杆菌EHA105

（1）从-80℃取出EHA105感受态，置于冰上，缓慢融化。

（2）将1μL载体质粒DNA加入100μL感受态细胞中，用移液器混匀，冰上放置30 min。

（3）液氮中迅速冷冻处理5 min。

（4）37℃水浴5 min后冰浴放置2 min。

（5）加入1 m L YEB培养液，28℃，200 r/min培养3 h。

（6）离心收集菌液，沉淀用200μL YEB悬浮，将菌体涂布于含100 mg/L Kan YEB平板上，28℃培养48 h，直至长出清晰可见的单菌落，挑取单菌落进行PCR鉴定。

5.1.3.11　农杆菌侵染转化百子莲胚性愈伤组织

取出超低温冰箱中保存的含有p TCK303-sense-intron-antisense质粒的农杆菌菌株LBA4404，划线接种于含有50 mg/L卡那霉素、25 mg/L链霉素与50 mg/L利福平的YEB抗性培养基上，放置于28℃恒温培养箱中倒置培养2 d。从YEB抗性平板上挑取单菌落，接种于5 m L含有相应抗性的YEB液体培养基中，置于摇床上28℃（200 r/min）震荡培养过夜。取1 m L活化后的菌液接种于50 m L含相同抗性的YEB液体培养基中，相同条件下震荡培养至菌液浓度OD600值为0.2～0.5。4 000 r/min离心5 min，弃上清，搜集菌体，用MS培养基等体积悬浮菌体，使用时采用MS培养基（含1.5 mg/L PIC，30 g/L蔗糖，20 mg/L AS）稀释至原液体积的20～50倍。

（1）将百子莲胚性愈伤组织用农杆菌菌液浸泡2～3 min。

（2）用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，将植物材料转入铺有一层滤纸的MS（含1.5 mg/L PIC，30 g/L蔗糖，20 mg/L AS）培养基上进行共培养，28℃暗培养5 d。

（3）共培养后，用MS液体培养基（含1.5 mg/L PIC，30 g/L蔗糖，500 mg/L Cb）悬浮植物材料，漂洗材料表面附着的菌体。

（4）漂洗后的材料用抽滤的方法转接到筛选培养基（MS+1.5 mg/L PIC+50 mg/L hygromycin+500 mg/L Cb+30 g/L蔗糖）上，放置于25℃恒温培养箱中进行暗培养，植物材料每2周继代一次，筛选转化细胞组织。

（5）筛选6～8周后，存活的胚性愈伤组织转接到分化培养（MS+500 mg/L Cb+30 g/L蔗糖）上，放置于25℃恒温培养箱中进行光照培养，进行体细胞胚诱导。

（6）2周后，当体细胞胚发育到3 mm大小时，将植物材料转接到不含生长调节剂与抗生素的培养基上（MS+30 g/L蔗糖），放置于25℃恒温培养箱中进行光照培养。

5.1.3.12　GUS组织化学分析

（1）将通过潮霉素抗性筛选的抗性细胞，放入GUS工作液中（配方见表5-13），37℃保温数小时或过夜。

（2）抗性细胞用75%的乙醇漂洗1～2次，直至阴性对照材料呈白色。

（3）用肉眼或解剖镜下观察拍照，白色背景下的蓝点即为GUS表达位点。

表5-13　GUS染色液配制方法