4.1.4.1 总RNA的提取与纯化
总RNA提取
（1）取2 g材料置于预冷的研钵中，液氮研磨至粉末状并转移至50m L离心管中（Axygen，RNase free），加入25 m L Trizol溶液（Invitrogen），震荡混匀后室温放置10 min。
（2）12 000 g 4℃离心5 min。
（3）小心吸取上清液，转入至新的离心管中；向上清液中加入1/5体积量的氯仿，盖紧离心管，剧烈震荡15 s，室温静置10 min，12 000 g 4℃离心15 min，小心吸取上清液至另一新的离心管中。
（4）向上清液中加入等体积的异丙醇，温和混匀，在室温下静置10 min，12 000 g 4℃离心10 min。
（5）小心弃去上清，缓慢地加入5 m L 75%的乙醇洗涤沉淀。
（6）12 000 g 4℃离心5 min后弃上清液；室温干燥沉淀2～5 min，加入适量的DEPC处理水溶解沉淀。
总RNA纯化
为防止基因组DNA影响后续试验结果，去除RNA中的基因组DNA污染，建立RNA纯化体系（见表4-1）。
表4-1 总RNA纯化体系
（续表）
（1）混匀后37℃水浴30 min。
（2）用50μL RNase-free H2 O定容至100μL后加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）混匀。
（3）室温，13 500 rpm离心5 min，取上清液。
（4）加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1）混匀。
（5）室温，13 500 rpm离心5 min，取上清液。
（6）加入10μL 3 M醋酸钠，250μL冷乙醇，冰上放置10 min。
（7）4℃，13 500 rpm离心15 min，弃上清液。
（8）加入75%预冷的乙醇洗涤，13 500 rpm 4℃离心5 min，弃上清液。
（9）沉淀于室温干燥2 min，用适量的RNase-free H2 O溶解。
RNA完整性及质量检测
取5μL RNA样品用1%琼脂糖凝胶电泳分析，120 V电泳30 min，检测r RNA的带型，观察RNA的完整性。另取1μL RNA样品，用Nano Drop 1 000微量紫外分光光度计检测RNA浓度和质量。
4.1.4.2 mRNA 富集纯化
按照Oligotex TM-d T30＜Super＞m RNA Purification Kit（Takara）操作说明建立m RNA富集纯化体系（见表4-2）。
表4-2 mRNA富集纯化体系
（1）将上述配制的反应液充分混匀后，70℃加热3分钟（RNA变性）；
（2）室温放置10 min（Oligotex TM-d T30和m RNA结合）；
（3）15 000 rpm离心5 min；
（4）除去上清（尽量不要吸入Oligotex TM-d T30），加入350μL的Wash Buf fer，将Oligotex TM-d T30充分悬浮后，加入Spin Column Set的Column Cup中；
（5）15 000 rpm离心30 s；
（6）向Column Cup中加入350μL的Wash Buffer，使Oligotex TMd T30充分悬浮后，将Spin Column移至新的Spin Column用离心Tube上；
（7）15 000 rpm离心30 s；
（8）将Spin Column移至新的Spin Column用离心Tube上；
（9）向Column Cup中加入20～50μL 70℃预热的DEPC H 2 O，充分悬浮Oligotex TM-d T30。15 000 rpm离心30 s，回收m RNA；
（10）重复操作步骤（9）2～3次。
4.1.4.3 3’-RACE与5’-RACE cDNA文库构建
构建5’-RACE与3’-RACE c DNA文库按照SMARTer TM RACE c DNA Amplification Kit（Clontech）用户手册进行操作，文库构建体系如表4-3所示。
表4-3 3’-RACE与5’-RACE cDNA文库第一链合成体系
（续表）
（1）将上述配制的反应液充分混匀后，42℃孵育90 min；
（2）70℃处理10 min停止反应；
（3）用DEPC处理水将反应体系稀释至250μL，分装后放置于-80℃超低温冰箱中保存。
4.1.4.4 TIR1基因3’末端序列扩增
根据百子莲转录组测序获得的TIR 1基因序列（附录1）为参考设计特异性引物（TIR 1 sense，TIR 1 antisense），进行PCR扩增验证转录组测序获得的TIR 1基因拼接序列的准确性。根据验证过的TIR 1核心序列设计3’-RACE与5’-RACE的特异性引物。TIR 1核心序列引物及3’-RACE与5’-RACE的PCR引物如表4-4所示。
表4-4 3’-RACE与5’-RACE PCR引物列表
(www.xing528.com)
按照表4-5建立TIR 1基因3’-RACE PCR扩增体系。
表4-5 3’-RACE PCR体系
扩增产物检测：取5～10μL扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测（120 V，30 min），观察扩增效果。剩余产物用dd H 2 O稀释30～50倍于-20℃保存备用。
按照表4-6建立TIR 1基因3’-RACE巢式PCR扩增体系以获得3’-RACE特异性扩增片段。取20μL 3’-RACE巢式PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，观察扩增效果。应用琼脂糖胶回收试剂盒对特异性扩增条带进行胶回收。
表4-6 3’-RACE巢式PCR体系
4.1.4.5 TIR 1基因5’末端序列扩增
按照表4-7建立TIR 1基因5’-RACE PCR扩增体系。
表4-7 5’-RACE PCR体系
扩增产物检测：取5～10μL扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测（120 V，30 min），观察扩增效果。剩余产物用dd H 2 O稀释30～50倍于-20℃保存备用。
按照表4-8建立TIR 1基因5’-RACE巢式PCR扩增体系以获得5’-RACE特异性扩增片段。
表4-8 5’-RACE巢式PCR体系
取20μL 5’-RACE巢式PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测（120 V，30 min），观察扩增效果。应用琼脂糖胶回收试剂盒对特异性扩增条带进行胶回收。
4.1.4.6 3’-，5’-RACE目的片段的克隆与测序
1）DNA片段载体连接与转化
按照TaRa Ka公司的p MD 18-T vector使用说明，将回收的产物连接于载体上，反应体系如下（见表4-9）。
表4-9 载体连接体系
用枪头小心吹打混匀样品，16℃低温水浴中静置30 min。
2）感受态制备
（1）37℃震荡培养大肠杆菌DH5-α（200转/分）3 h；
（2）无菌条件下将1 m L菌液转移至1.5 m L Eppendorf管中，冰浴20 min；
（3）4℃10 000 r/min离心4 min，弃上清；
（4）加500μL遇冷的0.1 M CaCl2重悬菌体，置于冰上30 min；
（5）4℃10 000 r/min离心4 min，弃上清；
（6）每管加200μL 0.1 M CaCl2重悬，冰上放置备用。
3）连接产物转化DH5-α感受态细胞
（1）取200μL感受态细胞，在无菌条件下，加入连接反应液10μL；
（2）轻轻混匀内容物，冰浴放置30 min，其间每10 min轻轻混匀一下；
（3）将管在42℃水浴热激60～90s，不要摇动；快速将Eppendorf管移入冰浴中，冷却2～3 min；
（4）在超净台中每管加800μL已灭菌的LB液体培养基（见表4-10），置于37℃摇床振荡培养（180 r/min），60～90 min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素标记基因。
4）涂板
（1）复苏后的菌液4 000 g离心5 min，弃掉800μL上清液；
（2）用枪头小心吹打混匀剩余的200μL菌液（无菌条件下）；
（3）在超净工作台上，将已经转化的感受态细胞全部转移到含氨苄青霉素（Amp+）的LB固体培养基平板上（见表4-11），用一个无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂布，直至液体被完全吸收，用封口膜封口后，37℃倒置培养12～16 h。
5）蓝白斑筛选
待板上长出合适大小的蓝白斑后，用灭菌的枪头挑取5个阳性单克隆（白斑），并打入已灭菌的1.5 m L离心管中，管中预置1.0 m L含有氨苄青霉素（Amp+）的液体LB培养基（见表4-10），37℃，200 r/min摇菌，直至合适浓度。
表4-10 LB液体培养基配方∗
∗培养基经高温灭菌后，保存于4℃冰箱中备用。液体抗性培养基则在使用前加入氨苄青霉素（每1 L培养基中加入1 m L Amp+）。
表4-11 LB固体培养基配方∗
∗培养基经高温灭菌后，在超净工作台中冷却到60℃时每升培养基中加入1 mL Ampicillin（100 mg/m L）、1mLIPTG（24 mg/mL）、2 mLX-Ga l（20 mg/mL），混匀后倒入培养皿中，待培养皿中LB培养基彻底冷却凝固后封膜，保存于4℃冰箱中备用。
6）阳性菌落（白斑）PCR扩增鉴定
取2μL菌液做模板进行PCR扩增，PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳分离；对于检测为阳性的菌落，将其相应菌液送到Invitrogen生物公司完成测序。
4.1.4.7 生物信息学分析
应用Clustal X（1.83）对测序获得的序列进行基因全长拼接。基因开放阅读框通过NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）在线软件ORF Finder查询确定。蛋白质的基本性质分析及三级结构预测通过SOPMA与I-TASSER在线软件（http：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/）进行分析。蛋白3D结构应用Py Mol软件进行绘制。蛋白的疏水性由ProtParam软件分析（http：//web.expasy.org/protparam/），蛋白见互作关系应用STRING软件分析（http：//string-db.org/）。应用Blast X进行氨基酸序列比对，使用MEGA 5软件完成系统发生树的构建。
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