百子莲愈伤组织胚性启动调控技术-实验设计与方法

3.1.4.1　百子莲胚性愈伤组织继代培养

培养基的配制方法同2.1.4.2，继代培养基中加入激素的种类与浓度为6个处理，分别为：PIC（1.0，1.5，2.0 mg/L）与NPA（0.5，1.0，1.5 mg/L）；观察百子莲胚性愈伤组织在不同激素浓度处理下的形态结构变化。

3.1.4.2　百子莲胚性愈伤组织显微结构观察

将不同处理的愈伤组织进行FAA（70%酒精∶冰醋酸∶福尔马林为90∶5∶5）固定，经系列酒精脱水，二甲苯透明后进行浸蜡、包埋处理，常规石蜡切片法制片，切片厚度8μm。切片经二甲苯脱蜡以后进行番红染色，中性树胶封片后于Olympus光学显微镜下观察并拍照。

3.1.4.3　百子莲胚性愈伤组织的组织化学定位分析

组织化学分析按照胡适宜的方法[29]，略有改动。将3.1.4.2中制好的切片经二甲苯脱蜡后，切片经过高碘酸锡夫（PAS）处理，观察多糖类物质在细胞组织中分布情况。PAS反应：切片在0.5%（w/v）高碘酸（0.3%硝酸配制）中浸泡10 min；自来水洗1～2 min，蒸馏水经过；锡夫试剂中处理30 min；偏亚硫酸氢钠溶液洗涤3次，每次2 min[30]；自来水清洗5 min后经过蒸馏水；系列酒精脱水，二甲苯处理后进行中性树胶封片，Olympus光学显微镜下观察并拍照。

3.1.4.4　百子莲胚性愈伤组织扫描电镜观察

将愈伤组织及不同处理条件下的胚性愈伤组织在2.5%戊二醛溶液中固定4 h；酒精逐级脱水；冷冻干燥器内进行样品干燥。制备后的样品平铺于贴有导电胶的电极上，经离子溅射仪镀金30 s后，用扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）观察样品表面形态结构。

3.1.4.5　百子莲胚性愈伤组织内源IAA含量测定

将植物材料用液氮避光研磨至粉末，称取500 mg进行冷冻干燥。加入5 m L提取液（80%甲醇+IAA同位素内标+微量抗氧化剂），4℃浸提过夜，4℃10 000 g离心20 min，取上清液，固形残渣再加5 m L80%甲醇重新悬浮，振摇1 h，重复上述离心步骤，合并上清液。上清液中加入40μL 1 M NH4 OH调整p H值。40℃减压浓缩至水相。加入2 m L1 M的甲酸溶液超声处理至完全复溶。4℃放置10 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液。把MAX阴离子交换固相萃取柱用2 m L甲醇和2 m L去离子水润洗后，将样品经过MAX离子交换柱。MAX离子交换柱分别用2 m L 1 M的甲酸溶液、2 m L 0.1 M NH 4 OH与2 m L含有0.1 M NH4 OH的60%甲醇溶液进行漂洗；然后进行洗脱，洗脱液分别为2 m L含1.25 M甲酸的70%甲醇溶液和2 m L含有1 M甲酸的90%甲醇溶液，将洗脱液40℃减压缩干，得到待测激素样品的干样。将干样用50μL液相色谱起始流动相（0.01%醋酸∶甲醇为90∶10）复溶，溶液过0.22μm微孔滤膜去除固体小颗粒，转入自动进样器专用样品管中待检测。进样体积：10μL，流速：恒流165μL/min。

3.1.4.6　百子莲胚性愈伤组织淀粉含量测定

采用碘显色法（徐昌杰等，1998），步骤如下：(www.xing528.com)

淀粉提取：取0.1 g新鲜材料，用1 m L 80%乙醇研磨，4 m L 80%乙醇少量多次冲洗研钵，收集匀浆合并入10 m L离心管，放入离心机内，设定7 000 r/min离心10 min，弃去含脂溶性杂质的上清液；再加入5 m L蒸馏水悬浮样品，放入离心机内，设定7 000 r/min离心10 min，弃去含水溶性杂质的上清液。完成上述准备工作后，开始提取淀粉。

残渣加5 m L 80%硝酸钙溶液充分震荡，将离心管放入水浴锅内沸水浴加热10 min；然后取出离心管，稍冷却后放入离心机，设定4 000 r/min离心4 min，收集上清液。重复残渣提取过程2次，将得到的上清液合并入25 m L容量瓶，以80%硝酸钙溶液定容，至凹液面底部到达刻度线。

标准曲线制作：准确配制100μg/m L淀粉溶液，用80%硝酸钙稀释得到淀粉含量分别为20、40、60、80、100μg/m L的标准溶液。取80%硝酸钙作空白，不同浓度标准溶液5 m L，各加入200μL 5 m M I2-KI溶液，摇匀后倒入光径1 cm的比色皿中，于620 nm波长下测定吸光值。以淀粉含量为横轴，吸光值为纵轴绘制标准曲线。

显色测定：取5 m L待测液，加入200μL 5 m M I2-KI溶液，摇匀后倒入光径1 cm的比色皿中，于620 nm波长下测定吸光值，计算样品中淀粉含量。

3.1.4.7　百子莲胚性愈伤组织脂肪酸组分测定

脂肪酸的测定参照Browse和Larkindale的方法[31-32]。取0.5 g植物样品，使用含有100μg/m L标准品（十七碳酸，C17∶0）^[1]和1N H2 SO4的甲醇溶液2.5 m L酸化处理；应用氮气排除并隔绝离心管中空气；置于80℃水浴中反应90 min；加入1.5 m L 0.9%的NaCl溶液和200μL正己烷，涡旋30 s；5 000 g离心5 min；取100μL上层有机相进行气相色谱质谱分析（GC/MS）。脂肪酸在GC/MS（AutoSystem XL GC和Turbo Mass MS）（Perkin Elmer Inc.，USA）中分离并测定。GC程序是在70℃稳定2 min，然后10 min升温到270℃，流速1 m L/min。

样品使用十七碳酸作为内标，计算相对百分含量；所有不饱和脂肪酸计算双键指数DBI，公式为：

DBI＝0×([16：0]+[18：0])+1×([16：1]+[18：1])+2×([16：2]+[18：2])+3×[18：3]。

方括号中数值是每种脂肪酸占总脂肪酸的摩尔百分含量。

3.1.4.8　数据统计分析

数据统计分析应用SAS 9.1软件进行一维方差最小显著性差异检测（ANOVA LSD，P＜0.05）。