百子莲愈伤组织胚性启动调控技术的实验设计与方法

2.1.4.1　外植体消毒

百子莲花芽分化过程中，在花苞开裂前进行花芽取材。流水冲洗30 min后，将材料放置于超净工作台中，2%次氯酸钠消毒处理15 min，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干材料表面的水分，用解剖刀将花梗和花药切割成0.5 cm的小块，接种于愈伤诱导培养基中。

2.1.4.2　培养基的配制

基本培养基为MS培养基，诱导方法按照试验设计添加不同种类浓度的激素。培养基中蔗糖浓度为3%，植物凝胶含量为0.3%，p H值为5.8，培养基在121℃高压灭菌锅中处理20 min后，将不同种类的激素经0.22μm微孔滤膜过滤后添加到培养基中。

100 mg/L激素母液配制方法：准确称取100 mg PIC与6-BA，分别用少量的无水乙醇和1 M NaOH充分溶解后，用dd H2 O定容至1 L后，放置于4℃冰箱中保存备用。

2.1.4.3　愈伤组织诱导

为筛选适宜于百子莲愈伤诱导的培养基，本研究采用2因素3水平全组合实验设计（见表2-1）。将外植体材料消毒处理后接种于相应的培养基中（见表2-2）。定期观察、记录并统计愈伤组织的诱导率。

表2-1　愈伤组织诱导培养基中添加的激素种类与水平

表2-2　百子莲愈伤组织诱导培养基配制表(www.xing528.com)

（续表）

2.1.4.4　愈伤组织增殖培养及胚性愈伤诱导

在多数植物组织培养中，外源生长素和细胞分裂素都是细胞离体培养所必需的植物激素，两者不同浓度配合应用不但可诱导细胞的分化和生长，而且能控制细胞的分化和形态建成[26]。另外一些研究表明：ABA对植物体细胞胚发生具有促进作用，并对畸形胚的形成具有明显的抑制作用[27]。低浓度的外源ABA能够明显地提高体细胞胚的发生频率与质量[28]。因此，本研究采用3因素3水平的正交实验筛选最佳愈伤组织增殖培养基与胚性愈伤诱导培养基（见表2-3和表2-4）。对继代培养的愈伤组织进行定期观察、称重，记录数据。

表2-3　愈伤组织增殖培养基中添加的激素种类与水平

表2-4　百子莲愈伤组织增殖培养基配制表