甘草属化学成分提取溶剂与测定的研究结果

1 目的

甘草是豆科（Leguminosae）蝶形花亚科（Papiliantae Taub．）甘草属（Glycyrrhiza）植物。目前认为其具生理活性的有效化学成分主要是甘草酸和黄酮类化合物。关于化学成分提取溶剂与方法，在实验研究及生产工艺中并无统一标准和要求。为了保证生理活物质的临床应用效果好、提取率高、药业生产应用便捷和成本低，而且有利于环保，我们进行了比较系统的实验与分析，加以总结与同行业者交流探讨。

1．1 甘草黄酮和甘草酸研究现状

到目前为止，国内外对甘草酸的研究已经很深入，不仅研究了化学成分和药理作用，而且研究了它的生产和开发；现已形成规模化生产。而对甘草黄酮的研究主要集中在化学成分和药理作用上，对它的提取分离研究的较少。所以在甘草有效成分的生产和开发中，将黄酮作为次要成分随药渣弃去，造成资源的极大浪费。随着对甘草的深入研究，表明黄酮类化合物具有明显的抗肿瘤、抗溃疡、解痉、抗菌、抗炎、抗变态反应、降血脂和镇痛的作用。近年来还发现甘草黄酮对艾滋病病毒有很强的抑制增殖作用，因此对甘草黄酮提取分离的研究越来越引起人们的重视。由于黄酮和甘草酸均具有广阔的应用领域，人们逐步认识到从甘草中提取这两种物质的重要性。例如，高素莲和王雪梅（2000）对甘草中皂甙和黄酮类化合物的提取分离进行了研究；马明和石巍（2000）从甘草中提取甘草酸和黄酮类化合物的研究等。但这些仅是初步研究，大多是利用常规的提取方法；其中提取时间长、成本高、提取效率低，均为制约黄酮和甘草酸工业化生产的发展因素。

1．2 超声辅助提取法

早在1927年，Richards和Loomis就已发现了超声的化学效应，但由于当时的电子和超声技术水平较低，超声的研究和应用受到很大的限制，随着科技的进步，各种高效、经济功率超声源的制备和提供已经变为现实，为超声在食品、生物、化学、医药等方面的应用提供了重要的条件。超声波是一种弹性机械振动波，它能产生强烈振动，产生高速度、强烈的空化效应、搅拌作用，因此能破坏植物的细胞，使溶媒能渗透到植物细胞中，从而加速药材中有效成分在溶媒中的溶解，缩短提取时间，提高有效成分的提出率，大量研究也证明了这一点。超声辅助提取法是一种省时、高效、环保的从中草药中提取有效成分的新方法。目前，超声提取技术工程放大问题已得到解决，并正逐步应用到工业生产中，提取器容积可达500升，相当于24m3常规提取罐的处理量。

2 试验部分

2．1 甘草（Glycyrrhiza uralensis）黄酮和甘草酸的提取

2．1．1 溶剂系统的选择

黄酮和甘草酸的提取溶剂较多，常见的有水、碱性水液、碱性醇液和有机溶剂等。水提法提取液中杂质较多，提取率低。有机溶剂提取法提取率高，但成本较高，杂质含量也较高。黄酮类物质大多具有酚羟基，甘草酸分子中有三个羧基。因此，可以用碱性水液或碱性稀醇浸出，经酸化后分别得黄酮类物质和甘草酸。常用的碱是氢氧化钠和石灰水。氢氧化钠水溶液的浸出能力强，但杂质较多不利于纯化；石灰水可以使一些鞣质或水溶性杂质沉淀生成钙盐沉淀，有利于浸液纯化，但是浸出效果不如氢氧化钠水溶液效果好，同时有些黄酮类化合物能与钙结合成不溶性物质，不被溶出。一般可以根据不同的原料使用不同的碱性溶液。从以上综合因素考虑，选定以下4种溶剂进行黄酮和甘草酸的提取：①石灰水液，②碱性醇液，③混合碱液，④碱性水液。在超声条件下提取两次，每次20min。提取结果见表1。

表1 超声条件下不同溶剂提取甘草酸和黄酮的百分含量

通过以上试验可知，在超声条件下联合提取甘草中的甘草酸和黄酮类化合物，碱醇溶液提取效果最佳，石灰水液最差。

2．1．2 溶剂浓度的选择

鉴于以上4种溶剂中碱醇溶液提取效果最佳，为了进一步优化提取溶剂，将碱醇溶液分别配为20％、40％、60％、80％、95％的不同浓度，在超声波条件下提取两次，每次20min。提取结果见表2。

表2 超声条件下不同碱醇浓度提取甘草酸和黄酮的百分含量

通过以上数据可以看出，随着溶剂浓度的增大，甘草酸和黄酮的百分含量也在增大，当浓度达到60％时百分含量开始下降。因此，60％的碱醇浓度提取效果最好。

2．1．3 超声工艺参数的选择

（1）固液比

固液比不同提取效果不同。试验发现固液比太大，影响超声提取器的循环和搅拌；固液比太小，浪费溶剂，提高成本，而且给后处理带来困难。在对大量文献资料综合分析基础上，结合试验具体情况，选定固液比为1∶8、1∶10和1∶12进行正交试验。

（2）超声功率

根据超声提取器的最佳功率范围，选择800W、1 000W、1 200W进行正交试验。

（3）超声温度

温度过低，会影响黄酮和甘草酸在提取溶剂中的溶出；温度过高，乙醇的挥发严重，而且杂质溶出增加，同时，高温消耗大量能源，提高生产成本。综合考虑，选定25℃、30℃、35℃进行正交试验。

（4）超声时间

以60％碱醇溶液为溶剂，固液比1∶10，功率1 000W，温度25℃下，进行超声提取，每10min取样一次，测定黄酮和甘草酸的含量。结果见表3。

表3 超声条件下不同时间提取黄酮和甘草酸的百分含量

从以上试验结果可以看出，随着提取时间的增加，黄酮和甘草酸的含量也在增加，20分钟后增长趋缓，40分钟后黄酮和甘草酸的含量下降，因此选择20min左右进行正交试验。

（5）超声次数

以60％碱醇溶液为溶剂，固液比1∶10，功率1 000W，温度25℃下，进行超声提取，每次20min，测定黄酮和甘草酸的含量。结果见表4。

表4 超声条件下不同次数提取黄酮和甘草酸的百分含量

从以上试验得出，提取次数越多，黄酮和甘草酸的含量越高，但是当提取3次后含量增长甚微，因此提取2～3次即可。

2．1．4 正交试验设计

在对以上单因子因素分析和试验的基础上，对影响黄酮和甘草酸提取效果的因素：超声功率、超声时间、超声温度、固液比进行L9（34）正交试验设计，同时对试验结果进行分析（表5、表6）。

表5 正交试验因素水平表

表6 L9（34）正交设计及结果

续 表

试验结果表明，4个因素中对甘草黄酮和甘草酸的提取效果影响最大的是温度，最小的是时间。最佳提取方法是A2B3C3D1，即超声功率1 000W，超声时间75（25，25， 25）min，超声温度35℃，固液比1∶8。

2．2 甘草中黄酮含量的测定

本试验对甘草中黄酮含量的测定进行了方法学研究，并对李学禹教授提供的各种甘草进行了黄酮含量测定。

2．2．1 方法选择及考察

紫外分光光度法是通过可见－紫外分光光度计产生可见光、紫外光照射某些不同物质，通过不同物质的吸收光谱不同，获得不同的吸收光谱曲线，且它们的吸光度与浓度成正比，即遵循朗伯－比尔定律。

紫外分光光度法作为药物的一种常用分析方法，尤其是在近十几年中，其方法学的研究已经得到普遍的认可。它在单一成分的测定中，具有很好的稳定性、重现性，而且快速、简捷，结果准确。

目前，甘草中总黄酮的测定大多用紫外分光光度法，以芦丁为对照品，按《中华人民共和国药典》比色法测定其含量。但据报道，甘草中黄酮成分以查尔酮类（如异甘草素、异甘草苷）和二氢黄酮类（如甘草苷、甘草素）化合物为主，利用二氢黄酮在10％KOH溶液的条件下转化为查尔酮，最大吸收波长转移至400nm以上的特性，在可见光区检测甘草中总黄酮的含量。我们选择了可从药检所购买、分子结构、理化性质与甘草苷很接近的柚皮苷为对照品来测定甘草中总黄酮含量。本方法中柚皮苷溶液的最大吸收波长与样品溶液的最大吸收波长很接近。测定结果表明，本法简单，重现性好，准确可行。

2．2．2 光果甘草（Glycyrrhiza glabra）中不同龄期、不同部位黄酮含量测定

（1）对照品溶液的制备

准确称取柚皮苷对照品适量，用甲醇溶解并定容于10m L容量瓶中，制得浓度为1．0mg·m L－1的对照品溶液。

（2）供试液的制备

准确称取一定量三年生光果甘草侧根粉末，加入甲醇50m L，超声提取两次，每次30min，过滤，收集续滤液，即得。

（3）最大吸收峰的确定

准确吸取柚皮苷对照品溶液0．10m L，加入5．00m L甲醇及2．50m L 10％KOH溶液，室温放置5min，用甲醇定容至50m L；另取柚皮苷对照品溶液0．10m L，直接用甲醇定容至50m L，作空白对照。于200～600nm波长处扫描，结果在417nm处有最大吸收。

准确吸取供试品溶液2．00m L，加入5．00m L甲醇及2．50m L10％KOH溶液，室温放置5min，用甲醇定容至50m L。另吸取供试品溶液2．00m L，直接用甲醇稀释至50m L，作空白对照。于200～600nm波长处扫描，结果在415～417nm处有最大吸收。

（4）标准曲线的绘制

准确吸取1．0mg·m L－1柚皮苷对照品溶液0．10m L、0．20m L、0．30m L、0．40m L、0．50m L、0．60m L，分别加入5．00m L甲醇及2．50m L 10％KOH溶液，室温放置5min，用甲醇定容至50m L，在417nm处测定其吸光度值（表7）。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A＝40．115c－0．004 3，r＝0．999 9，线性范围为1．98～11．88μg。

表7 柚皮苷标准品吸光度值

（5）重复性试验

准确称取6份三年生光果甘草水平根粉末，分别加入25m L甲醇，超声提取2次，每次30min，过滤，收集续滤液。各取上述样品溶液5．00m L，加入5．00m L甲醇及2．50m L 10％KOH溶液，室温放置5min，用甲醇定容至25m L。再各取上述样品溶液5．00m L，直接用甲醇定容至25m L，作空白对照。于417nm处测定（表8）。测得光果甘草中黄酮平均含量为1．61％，RSD＝1．9％（n＝6）。

表8 重复性试验结果

（6）回收率试验(www.xing528.com)

准确称取三年生光果甘草主根粉末6份，分别置于容量瓶中，各加入柚皮苷对照品溶液0．20m L及25m L甲醇，超声提取2次，每次30min，过滤，收集续滤液。准确吸取上述样品溶液5．00m L，依法操作，测吸光度，计算回收率（表9）。结果平均为100．3％， RSD为1．4％（n＝5）。

表9 加样回收率试验结果

（7）含量测定

准确称取不同龄期、不同根系光果甘草生药材粉末各1份，分别加入50m L甲醇，超声提取2次，每次30min，过滤，收集续滤液。准确吸取各样品液2．00m L，按上述方法测定，并计算各药材中总黄酮的百分含量（表10）。

表10 光果甘草生药样品中黄酮测定结果

（8）结果分析

1）在甘草试验生长年度内，光果甘草中黄酮的含量与生长年限呈正相关，随着生长年限的增加，黄酮的含量逐渐增长，且相应各龄期光果甘草侧根、主根、水平根中黄酮的含量也呈上升趋势。如图1a所示。

图1 不同生长年限及不同根系之间与黄酮含量的关系

2）无论是一年生甘草、二年生甘草或三年生甘草，其主根、侧根、水平根中黄酮的含量都呈一定的规律性，即水平根黄酮含量最高，其次为主根，含量最低的为侧根。随着光果甘草生长年限的增加，主根、侧根、水平根中黄酮的增长比率也在上升。如图1b所示。

2．2．3 无腺毛甘草（Glycyrrhiza eglandulosa）中总黄酮含量测定

（1）供试液的制备

准确称取一定量无腺毛甘草粉末，用50m L甲醇等量索氏提取2次，每次2h，过滤，收集续滤液，保存待测。

（2）最大吸收峰的确定

准确吸取柚皮苷对照品溶液0．10m L，加入5．00m L甲醇及2．50m L 10％KOH溶液，室温放置5min，用甲醇定容至50m L；另取柚皮苷对照品溶液0．10m L，直接用甲醇定容至50m L，作空白对照。于200～600nm波长处扫描，结果在417nm处有最大吸收。

准确吸取供试品溶液2．00m L，加入5．00m L甲醇及2．50m L 10％KOH溶液，室温放置5min，用甲醇定容至50m L。另取供试品溶液2．00m L，直接用甲醇定容至50m L，作空白对照。于200～600nm波长处扫描，结果在405～407nm处有最大吸收。

（3）重复性试验

准确移取无腺毛甘草侧根提取液5．00m L 6份，加入2．50m L甲醇及10％KOH溶液，室温放置5min，用甲醇定容至25m L。再取上述样品溶液5．00m L，直接用甲醇定容至25m L，作为空白对照。于417nm处测定（表11）。测得无腺毛甘草侧根中黄酮平均含量为1．287％，RSD＝0．74％。

表11 重复性试验结果（n＝6）

（4）稳定性试验

精密移取侧根供试液5．00m L，按标准曲线项方法操作，于1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h分别测其吸收度。结果表明，本法测定总黄酮在8h内稳定，RSD＝0．48％。

（5）样品测定

准确称取不同部位无腺毛甘草粉末各3份，用50m L甲醇等量索氏提取2次，每次2h，过滤，收集续滤液。分别准确吸取各样品液5．00m L，按上述方法测定，计算其黄酮的百分含量，结果见表12。

表12 不同根系黄酮含量测定结果（n＝3）

（6）回收率试验

准确移取无腺毛甘草茎提取液5．00m L 5份，分别置于25m L容量瓶中，各加入柚皮苷对照品溶液0．10m L，依法操作，测其吸光度。计算回收率（表13），回收率平均为98．61％，RSD为0．32％（n＝5）。

表13 回收试验结果（n＝5）

续 表

（7）结论

从测定结果可知，两年生无腺毛甘草水平根中总黄酮的含量最高，为1．56％，主根与侧根含量无明显差异，为1．28％，茎中总黄酮含量最低，为0．73％，如图2所示。

图2 无腺毛甘草不同根系及茎与黄酮含量的关系

2．3 不同提取方法对黄酮含量测定的影响研究

2．3．1 对照品溶液的制备

精密称取芦丁标准品适量，用甲醇溶解，定容于50m L容量瓶中，制得浓度约为0．2mg·L－1的对照品溶液。

2．3．2 供试液的制备

（1）微波提取法

精密称取1．500 0g甘草粉末，用100m L甲醇分为40m L、30m L、30m L依次提取，每次提取时间为20min，过滤，3次提取所得清液混合备用。

（2）超声提取法

精密称取1．500 0g甘草粉末，用100m L甲醇分为40m L、30m L、30m L依次提取，每次提取时间约为20min，过滤，3次提取所得清液混合备用。

（3）索氏提取法

精密称取1．500 0g甘草粉末，用100m L甲醇分为60m L、40m L依次提取，每次提取时间约120min，提取后过滤，2次提取所得清液混合备用。

2．3．3 最大吸收峰的确定

精确吸取芦丁对照品溶液2．00m L，加5％亚硝酸钠溶液0．4m L，摇匀后静置6min，加10％硝酸铝溶液0．4m L，摇匀后静置6min，加10％氢氧化钠溶液4m L，摇匀，用蒸馏水定容至10m L，摇匀，静置15min。于波长400～600nm区间处扫描，结果在510nm处有最大吸收。

2．3．4 标准曲线的绘制

精确吸取0．20mg／m L芦丁对照品溶液1．0m L、2．0m L、3．0m L、4．0m L、5．0m L，加5％亚硝酸钠溶液0．40m L，摇匀后静置6min，加10％硝酸铝溶液0．40m L，摇匀后静置6min，加10％氢氧化钠溶液4．00m L，摇匀，用蒸馏水定容至10m L，静置15min，在510nm处测定其吸光值。以吸光度为纵坐标，对照品溶液的浓度（mg／m L）为横坐标，得线性回归方程：A＝10．176c＋0．0542，r＝0．998 0。

2．3．5 回收率试验

精密称取多年生药材，加入芦丁对照品适量，分别用微波提取法、超声提取法、索氏提取法提取，并按绘制标准曲线的方法进行回收率试验（表14）。

表14 回收率试验

2．3．6 重复性试验

精密称取多年生药材，分别用微波提取法、超声提取法、索氏提取法提取，并按绘制标准曲线的方法进行重复性试验（表15）。

表15 重复性试验（n＝3）

2．3．7 样品测定

精密称取多年生药材，分别用微波提取法、超声提取法、索氏提取法提取，并按制定标准曲线的方法进行含量测定（表16）。

表16 样品含量测定

2．3．8 结果与讨论

从表14测定结果可知，各提取法的回收率均较好。从表15测定结果来看，超声提取法的精密度优于其他两种方法。从表16可以看出，索氏提取法的含量测定结果略高，这可能是由于索氏提取法为加热、连续回流提取过程，对于提取过程中溶剂的挥发损失不能及时弥补所致，并且这种方法耗时较长，所用试剂甲醇对人体危害较大。超声提取法能在较短时间内破坏甘草的细胞壁，使得黄酮大量溶于有机溶剂，在提取过程中能较好克服溶剂挥发损失这一不足，省时省力，因此不失为一种较理想的提取方法。据此，我们选用超声提取法对甘草样品进行含量测定，获得满意的结果。

李炳奇 刘红 汪河滨 郁晓艺 李学禹

国家科技部新疆生产建设兵团攻关专项课题：2001EP050012