龄期栽培甘草黄酮和甘草酸定位及规律研究

摘 要：本研究通过冷冻切片、组织化学、植物化学方法，对1、2、3年生与8年生栽培光果甘草（Glycyrrhiza glabra L．）总黄酮、甘草酸的组织化学定位及含量的动态变化进行研究，揭示了不同龄期栽培光果甘草总黄酮、甘草酸在不同营养器官组织细胞中积累、分布特点和消长规律。研究主要结论如下。

1．光果甘草总黄酮、甘草酸的组织化学定位研究。

（1）总黄酮在叶中分布在腺毛、表皮、胶囊细胞、厚角组织和维管束韧皮部中；茎中分布在表皮（周皮）、韧皮部与黏液细胞中；根中则分布在周皮中。

（2）甘草酸（甘草皂甙）在根、根状茎中分布在周皮、韧皮部和木质部的薄壁细胞、射线细胞中。

（3）总黄酮、甘草酸分布和积累的特点与其解剖结构的抗逆性有密切关系，体现了光果甘草解剖结构、次生代谢物与生态适应的一致性。

2．不同龄期栽培光果甘草总黄酮含量及消长规律研究。总黄酮在光果甘草地上、地下营养器官均有分布和积累，但具有时间和空间的异质性。

（1）不同龄期栽培光果甘草总黄酮含量比较。不同龄期栽培光果甘草地上营养器官总黄酮含量无显著差异，地下营养器官总黄酮含量随生长年限有所上升：3年生最高，2年生与8年生次之，1年生较低。这说明光果甘草总黄酮的积累是随地下营养器官的生长和增粗而增加，而每年由地面芽或地下芽形成的地上营养器官的生长和总黄酮的积累并无龄期的差别。

（2）栽培光果甘草不同营养器官总黄酮的积累和分布比较。不同龄期总黄酮积累和分布的空间异质性相似，总黄酮含量在不同营养器官的高低顺序均为：叶＞毛状根、水平根茎＞侧根、主根、垂直根茎＞茎；在总黄酮积累和分配过程中，植株存在2个转移和积累趋势：上部叶（嫩叶）和毛状根作为植株新陈代谢的旺盛部位，可能是产生黄酮类物质的主要器官，在地上部位，上部叶通过茎转移到成熟叶和地下营养器官；在地下部位，毛状根通过水平根茎、次级侧根逐步向储藏器官上级侧根、主根积累。

（3）不同龄期栽培光果甘草总黄酮的季节动态变化。在一个生长季中，不同龄期栽培光果甘草总黄酮含量波动均显示出相同规律：5—6月、9月、10月含量较高，总黄酮含量与生长季节中的温度等因素密切相关，高温、高辐射（7月、8月）抑制总黄酮形成。

3．不同龄期栽培光果甘草甘草酸含量及消长规律研究。栽培光果甘草甘草酸主要在地下营养器官积累，地上痕量或无，其积累过程具有时间和空间差异。

（1）不同龄期栽培光果甘草地下营养器官甘草酸含量比较。3年生最高，8年生和2年生次之，1年生最低。这说明人工栽培的光果甘草甘草酸积累主要在1～3年、4年，超过4年以上光果甘草由于根的木质化程度增加，甘草酸积累的主要部位薄壁细胞比例减少，甘草酸的积累趋于缓慢，含量下降。

（2）不同龄期栽培光果甘草水平根茎、侧根和主根的甘草酸含量均高于垂直根茎，垂直根茎不是甘草酸的主要储存器官；随着龄期增加，甘草酸分布和积累部位呈现由水平根茎向主根、侧根转移的趋势。

（3）在一个生长季节中，不同龄期栽培光果甘草甘草酸含量的动态变化呈相似的变化规律，即从4—6月、7月，甘草酸含量呈上升趋势，6月、7月达到最高值。

4．药材采收建议：栽培光果甘草大于3年生（包括3年生）就可以进行药材的采挖，最佳采收期为6月，可同时采收地上、地下部位，达到综合利用的目的，但不提倡采收栽培年限太长的药材；另外，对小于3年生的栽培光果甘草，每年地上部分的叶和茎可以在9—10月，植株生长趋于减弱、进入冬季休眠前进行收获，也可以增加收益。

关键词：光果甘草；总黄酮；甘草酸；组织化学；消长规律

甘草属的主要有效成分为黄酮类化合物、三萜类化合物［甘草酸（glycyrrhizic acid）或甘草甜素（glycmhizin）及甘草次酸（glycyrrhetinic acid）等］和甘草多糖等（张继等，2000）。据现有资料报道，国内外已从甘草属中分离出300多种黄酮类化合物（包括香豆素类）（季宇彬等，2004），近100多种三萜类化合物以及18种氨基酸（王少珩等，1993），多种生物碱，多糖（刘金荣等，2004b），雌性激素和多种有机酸等（Hayashi et al．，1996）。药理研究表明，甘草酸与甘草次酸具有镇痛、消炎、解毒、抗龋齿、抗过敏、抗肿瘤和抗消化道溃疡的作用，还可以预防艾滋病、癌症以及病毒性肝炎等（李璘等，2004；陶晡等，2009；Raphael et al．，2003）。黄酮与甘草酸相比除具用抗病毒、抗肿瘤、护肝等作用外，还具明显的抗衰老、抑菌、抗氧化、增加白细胞、抗动脉硬化、抗心律失常等作用，特别是在抗艾滋病的作用被发现后，掀起了研究黄酮类化合物的热潮（田庆来等，2006；张聿梅等，1997）。其中，光果甘草特有的主要异黄酮类成分光果甘草定（glabridin，GLB）在其总黄酮中含量最高，达到11％，具有一定程度的降血脂与降血压、保护神经细胞作用，以及较强的抗氧化等作用，并在心脑血管疾病的预防中展现出良好的前景（Fahn，1986；Yu et al．，2008；木合布力·阿布力孜等，2008）。此外，它与光果甘草另一独有的黄酮类成分——光甘草素都能有效清除超氧离子，显著抑制酪氨酸酶活性，有强烈防止紫外线引起的色素沉淀和皮肤粗糙等作用（王建国等，2004），被认为是极其重要化妆品的增白剂原料，备受人们青睐。

近年来，由于野生甘草资源紧缺，而市场的需求量大，人工栽培已成为药用甘草资源利用中的一个重要课题。栽培甘草的报道主要集中在化学成分的提取、分析及含量测定（李炳奇等，2005，2006；刘金荣等，2004；汪河滨等，2004；马君义等，2008；王晋等，2007；彭励等，2008）等方面。但对栽培光果甘草药用化学成分的形成和消长规律研究较少（户元林等，2005；刘红等，2005）。本研究选择人工栽培光果甘草，在了解土壤基本离子和有机质的背景条件下，按照药材标准，通过对不同龄期植株各营养器官进行总黄酮和甘草酸的组织化学定位及含量测定，探索人工栽培光果甘草中总黄酮和甘草酸的分布、消长规律，为确定栽培光果甘草合理的采收龄期、采收季节和采收部位提供科学依据。

1 栽培光果甘草总黄酮、甘草酸的组织化学定位

1．1 材料与方法

1．1．1 材料

1、2、3年生栽培光果甘草（Glycyrrhiza glabra L．）来自2009年播种，样地位于新疆石河子市二宫乡；8年生光果甘草，位于新疆石河子大学农学院实验站。地处北纬44°45′，东经85°45′，气候属于温带半干旱大陆性气候类型，年平均降水量300～500mm，主要集中在6—8月；年平均气温2．4～2．7℃，≥10℃年有效积温3 000～3 500℃，年平均蒸发量1 500～2 000mm。每年取样材料分不同营养器官：叶、茎、根、根状茎，材料取回立即进行组织化学实验。同时采集土样进行理化性质测定（表1），结合土壤盐化划分标准（许志坤，1979），可知样地土壤均属于非盐化土，其类型为氯化物－硫酸盐土。

表1 栽培与8年生光果甘草样地的土壤总盐、有机质、离子含量

1．1．2 方法

1．1．2．1 总黄酮的组织化学定位

采用氢氧化钠和三氯化铝两种不同的显色剂对光果甘草营养器官中总黄酮进行组织化学定位（谭玲玲等，2007；上官小东等，2004；徐国均等，1996）。冷冻切片机切片，厚度为30μm，切片分别用1％的三氯化铝溶液和1％的氢氧化钠溶液染色10min，盖上盖玻片，立即于显微镜和荧光显微镜下观察并拍照。通过两种不同的染色方法确定光果甘草各器官中总黄酮的分布和积累部位。

1．1．2．2 甘草酸的组织化学定位

采用等体积5％香草醛－冰醋酸与高氯酸的混合液对光果甘草中甘草酸（又称甘草皂甙）进行组织化学定位（曹玲，2003）。冷冻切片机切片，厚度为30μm，切片用5％香草醛－冰醋酸与高氯酸的混合液染色10min，盖上盖玻片，立即于显微镜下观察并拍照。通过此方法确定甘草酸在光果甘草各器官中的分布和积累部位。

1．2 结果与分析

1．2．1 栽培光果甘草根、茎、叶解剖学的结构特点

1．2．1．1 叶的结构

光果甘草叶为异面叶，由表皮、叶肉和叶脉组成。表皮具薄的角质层，上、下表皮均为一层排列紧密的细胞；具非腺毛，不分枝，单一，弯曲或直伸；同时还具有多细胞头的腺毛（图版ⅩⅥ，1）。叶肉细胞分化为海绵组织和栅栏组织。栅栏组织发达，由2～3层柱状细胞组成，栅栏组织中还存在大量的胶囊细胞（王常贵等，1984）（图版ⅩⅥ，1）；海绵组织排列疏松，不规则。叶脉中主脉发达，近下表皮处有厚角组织（图版ⅩⅥ，1），维管束排列呈半圆形。

1．2．1．2 茎的结构

光果甘草地上成熟茎为圆形，由表皮、皮层和维管柱组成，下部茎经过次生生长后形成周皮、皮层和次生维管组织。表皮为一层排列紧密的长方形细胞；皮层由近表皮的2～3层厚角组织和薄壁细胞组成（图版ⅩⅥ，3）；维管柱是由髓、髓射线和维管束构成，排列呈环形。维管束为典型的外韧维管束，即韧皮部的外方具有纤维组织；茎的中央为髓，是由排列疏松的薄壁细胞组成，具黏液细胞（图版ⅩⅥ，3）。

1．2．1．3 根的结构

光果甘草根的结构从外到内由周皮和次生维管组织构成（图版ⅩⅥ，8）。周皮具厚的木栓层，木栓层由多层扁平的木栓细胞、木栓形成层和栓内层构成，栓内层内有4～5层薄壁细胞；次生维管组织由次生木质部、次生韧皮部和射线构成。外方为次生韧皮部，分散呈束状排列在韧皮部中，具有发达的韧皮纤维；内方为次生木质部（图版ⅩⅥ，8），木纤维存在导管之间由呈径向排列的细胞群组成，导管分子呈单个或几个辐射状纵向排列；维管射线由薄壁细胞构成，在韧皮部处细胞呈现切向加宽，使韧皮射线由内向外形状上似喇叭形，在木质部处由1～2列狭长细胞将木质部导管分子分为多列；根中央无髓，依稀可见初生木质部为3～4原型。

1．2．2 栽培光果甘草总黄酮在组织细胞中分布和积累特点

1．2．2．1 氢氧化钠溶液的组织化学定位

氢氧化钠溶液能与黄酮类物质发生显色反应，呈现出黄色→橙色→深红色的颜色变化（谭玲玲等，2007）。依照光果甘草营养器官的解剖结构，其组织化学定位研究表明：黄酮类物质在不同营养器官的积累和分布情况存在差异。在叶中，腺毛、表皮细胞、下表皮内方的厚角组织、部分维管束和叶肉细胞之间的胶囊细胞呈黄色，叶肉细胞未显色（图版ⅩⅥ，1）；在茎中，次生韧皮部、表皮（周皮）和髓部黏液细胞均呈橘黄色，其他组织未显色（图版ⅩⅥ，3）；在根中，周皮呈黄色，其他组织均未显色（图版ⅩⅥ，8）。

1．2．2．2 三氯化铝溶液的组织化学定位

三氯化铝溶液能与黄酮类物质发生反应，产生黄色络合物，在荧光显微镜下观察呈现黄色、黄绿色和天蓝色荧光（上官小东等，2004；徐国均等，1996）。光果甘草荧光显微结构观察结果表明：在叶中，腺毛、表皮、下表皮内方的厚角组织与叶肉细胞中的胶囊细胞显黄色荧光，木质部和韧皮部之间的薄壁细胞有少量黄绿色荧光（图版ⅩⅥ，2）；在茎中，表皮（周皮）、次生韧皮部和髓中的黏液细胞呈黄色荧光，韧皮射线薄壁细胞显淡黄色（图版ⅩⅥ，4）；在根中，周皮呈天蓝色荧光，除木质部导管外，其他组织的薄壁细胞呈淡黄色荧光（图版ⅩⅥ，6）。

1．2．2．3 香草醛－冰醋酸和高氯酸的组织化学定位

甘草酸（又称甘草皂甙）物质能与5％香草醛－冰醋酸和高氯酸的混合液发生显色反应，呈现出淡红色→红色→紫红色的颜色变化（林如等，2002）。依照光果甘草营养器官的解剖结构，其组织化学定位研究表明：在根与根状茎中，周皮、除木质部导管外的其余组织的薄壁细胞（韧皮部和木质部的薄壁细胞、射线细胞）均呈紫红色（图版ⅩⅥ，7、8）。

1．3 结论与讨论

1．3．1 总黄酮与甘草酸的积累与分布

光果甘草总黄酮、甘草酸的组织化学定位研究结果表明：总黄酮在叶中分布在腺毛、表皮、胶囊、厚角组织和维管束韧皮部；茎中分布在表皮（周皮）、韧皮部与髓的黏液细胞中，部分皮层和射线薄壁细胞有少量分布；根中则分布在周皮中。甘草酸（甘草皂甙）在根、根状茎中均分布在周皮、除木质部导管以外的薄壁细胞组织内，如韧皮部和木质部的薄壁细胞、射线细胞。

1．3．2 化学成分分布和积累特点与解剖结构的抗逆功能的相关性

光果甘草在我国主要分布在新疆，具有抗盐碱、抗寒、耐热、耐旱等优良特性，是干旱、半干旱地区重要的植物资源之一。本研究结果表明，光果甘草营养器官与其他甘草属植物有相类似的结构（马春英等，2009），但组织化学定位结果显示其化学成分分布和积累的部位与其解剖结构的抗旱性、高温等有密切关系。①叶片具有抗旱特点的解剖结构往往也是总黄酮分布和积累的主要场所：光果甘草叶片存在排列紧密的表皮细胞、表皮毛和腺毛，叶肉细胞中存在大量胶囊细胞。相关文献表明这些都是体现其抗旱性的结构特征。Fahn（1986）在研究旱生植物表皮毛的功能后发现，旱生植物的表皮毛具有良好的隔水保水功能。叶肉组织中的胶囊可以认为是一种吸附水分的结构（王常贵等，1984），为周围的叶肉细胞提供了一个温润的小气候，是对水分缺乏的一种适应。组织化学定位的结果显示黄酮类物质也主要积累在这些组织细胞中（表皮细胞、表皮毛和腺毛、胶囊细胞）。黄酮类化合物是一类具有多种药理及生物活性的重要次生代谢产物，在植物体内起到抗紫外线灼伤、抵抗病菌入侵、抵御天敌和提高植物对物理环境的适应等方面都有一定的作用（邹凤莲等，2004；Romero et al．，2005），表皮细胞、腺毛、胶囊和黏液细胞中黄酮类物质大量分布与积累，这在叶片抵御干旱、强日照等逆境过程中扮演着重要的角色，具有重要的生态适应意义。②茎和根中，其周皮中存在大量黄酮类物质的分布，通常认为，周皮的木栓层可起到绝热隔水的作用，当甘草处于高温或者低温环境时它可以保护内部组织不受伤害；此外，它还可以防止土壤中高浓度的盐碱对甘草根与根状茎的损伤。茎和根中周皮内大量黄酮类物质的积累可能也在植株周皮的保水、绝热、隔离等抗性功能中起着重要作用。

甘草酸又称甘草甜素、甘草皂甙（苷），由甘草次酸和2分子葡萄糖醛酸构成，属于三萜皂甙类化合物（刘长利，2005）。甘草酸代谢途径可简化为：光合作用产物→乙酰辅酶A→甲羟戊酸→角鲨烯→香树脂醇→甘草酸（Hayashi et al．，2001）。甘草酸是甘草属植物的主要次生代谢物质和药用活性成分，药用甘草之所以能够生存在极端干旱的荒漠地区，是因为甘草酸等次生代谢物质的积累，在严重脱水时可有效地保护了植物细胞膜结构和功能大分子免受伤害（刘长利等，2008），即甘草酸具有很强的保水功能。本研究中，光果甘草根、根状茎中，除了木质部和韧皮部的导管纤维细胞外，从周皮到根的内部的所有薄壁细胞组织内（韧皮部和木质部的薄壁细胞、射线细胞）中均存在大量甘草酸的分布和积累，这对光果甘草地下根系在干旱、盐碱缺水的环境中能正常生长发育具有重要生态学意义。本研究结果也恰恰验证了植物营养器官的结构特征、营养器官本身的次生代谢产物的积累、环境适应性三者存在密切的相关性，也体现了光果甘草解剖结构、次生代谢物与功能的一致性。

2 光果甘草总黄酮消长规律的研究

2．1 材料与方法

1、2、3年生栽培光果甘草（Glycyrrhiza glabra L．），8年生光果甘草取样土壤背景同表1。

2．1．1 材料

1、2、3年生栽培光果甘草（Glycyrrhiza glabra L．）来自2009年播种，2009—2011年同一样地逐年取样的材料，代表了不同龄期；8年生光果甘草来自2002年播种。以上材料分别在每年的不同生长月份（4—10月）或不同季节（春、夏、秋）取样，每次采集分别按“W”型取5个样点，每样点挖取生长状况一致的植株3～5株。

地上部分按茎的节数将茎平均分为上、中、下，叶依次为上部叶、中部叶和下部叶；地下部位按主根、侧根、水平根、垂直根茎、毛状根分开取样。取样标准如下。

主根：从根头算40cm，平均分为上、中、下三部分，根粗用游标卡尺测定相应部位的平均粗度（mm）。

侧根：取与主根或母根相连，距主根或母根0～10cm，粗度大于0．4～0．5mm的侧根。

水平根茎：取与直根或母根相连，距主根或母根0～20cm的水平根茎，并将其分为0～10cm和10～20cm，粗度按其相应部分的平均值计算。

垂直根茎：茎与主根相连的过渡部分，该部位通常无侧根分布，粗度取其平均值。

将同一采集时间不同植株的同一部位样品混合，样品置于烘箱中，40℃干燥后粉碎、过60目筛，放于干燥避光处保存待测。

2．1．2 方法

2．1．2．1 仪器与试剂

实验所用仪器包括UV－1100Lab Tech紫外－可见分光光度计（北京莱伯泰科仪器有限公司），KQ－50R型超声波提取器（昆山市超声仪器有限公司），BS423S电子天平（德国Sartorius公司），80－2T台式高速离心机（江苏省金坛市医疗仪器厂）。

甘草苷（Liquiritin）标准品（纯度大于98％，批号：090708）购于上海融禾医药科技发展有限公司；甲醇、氢氧化钾均为分析纯；实验用水为双蒸水。

2．1．2．2 标准曲线的配制

采用紫外－可见分光光度法测定（冯薇等，2007）。精密称取干燥至恒重的甘草苷标准品5．0mg置于5m L容量瓶中，加甲醇5m L溶解，摇匀，即得1．0mg／m L的甘草苷标准品储备液。精密吸取20μL、40μL、60μL、80μL、100μL、120μL的甘草苷标准品储备液，分别置于10m L离心管中，依次加入500μL甲醇和250μL质量体积分数10％氢氧化钾，摇匀，室温放置5min，加甲醇定容至5m L，摇匀。以甲醇、氢氧化钾作为空白参比液，于334nm波长测定吸光值，以吸光值（Y）对浓度（X）作回归统计分析，回归方程为：Y＝0．062 9X－0．004 0，R2＝0．999 2，在4．000 0～24．000 0μg／m L范围内线性相关良好。

2．1．2．3 样品溶液中总黄酮的提取和含量测定

总黄酮的提取参考冯薇等（2007）方法略有改动。精密称取样品粉末25．0mg，置于10m L离心管中，加入5m L甲醇，称重，超声提取70min，称重，补足损失重量，5 000rpm离心15min，上清液即为总黄酮提取液。每个样品重复提取3次。精密吸取样品提取液250μL，置于10m L离心管中，按上述标准曲线测定方法于334nm处测定不同样品的吸光值，根据上述得出的标准曲线计算总黄酮含量。

2．1．2．4 方法学考察

在线性范围内，按上述标准曲线测定方法，取2年生栽培光果甘草的主根（2010年4月9日采集）总黄酮提取液250μL连续测定6次，RSD为1．52％，表明仪器精密度良好。

精密称取2年生栽培光果甘草（2010年4月9日采集）主根粉末6份，每份25．0mg，按上述方法制备样品溶液，显色后测吸收值，RSD为1．98％，表明本方法的重现性较好。

精密称取2年生栽培光果甘草（2010年4月9日采集）主根粉末6份，每份25．0mg，按上述方法制备总黄酮提取液，分别于0、5、10、20、30、40min测定吸收值，结果随着时间延长，吸收值逐渐降低，在5～30min相对稳定，RSD为1．85％，这与文献报道显色30min内稳定吻合（刘金荣等，2004b），故确定测定时间为5～30min。

取已知总黄酮含量的2010年4月9日采集的2年生栽培光果甘草主根提取液6份，分别加入20、40、60、80、100、120μL的甘草苷标准品储备液，按上述标准曲线方法测定吸光值。回收率为96．34％～102．44％，平均加标回收率为98．93％，RSD为2．10％。

2．2 结果与分析

2．2．1 1年生栽培光果甘草总黄酮的含量变化

由表2可知，不同采集时间（温度下降前、后），10—11月，地上部分叶、茎总黄酮含量呈逐渐下降趋势，地下部分主根、侧根、根茎和毛状根的含量上升。上部叶显著高于中部叶；茎的不同部位总黄酮含量均较低；主根的含量小于水平根茎。不同部位总黄酮含量的高低顺序为：上部叶＞水平根茎、毛状根＞垂直根茎、侧根＞中部茎、中部叶、主根＞上部茎、下部茎。

表2 1年生栽培光果甘草不同采集时间各部位的总黄酮含量

2．2．2 2年生栽培光果甘草总黄酮的含量变化(www.xing528.com)

2．2．2．1 地上部位不同时期总黄酮的含量变化

研究表明：2年生栽培光果甘草地上营养器官总黄酮含量的高低顺序为：上部叶＞中部叶＞上部茎＞中部茎、下部茎。图1表明，地上营养器官在6—11月，上部叶总黄酮含量均显著高于其他部位，6、10月分别达到最高值：11．36％和11．76％。中部茎和下部茎总黄酮含量最低，随月份变化不显著。图1还可以看出，6—8月，地上叶除中部叶外，总黄酮含量呈下降趋势；8—9、10月，总黄酮含量逐渐上升；10—11月，除下部茎外，地上各营养器官总黄酮含量迅速下降至最低。

图1 2年生栽培光果甘草地上部位不同时期总黄酮含量变化

2．2．2．2 地下部位不同时期总黄酮的含量变化

由图2可以看出，2年生栽培光果甘草地下营养器官总黄酮含量的高低顺序为：毛状根＞水平根茎＞侧根＞主根、垂直根茎。毛状根、主根和侧根的总黄酮含量均在6月份最高，分别为3．61％、2．42％和3．35％，显著高于垂直根茎（1．55％）。

图2 2年生栽培光果甘草地下部位不同时期总黄酮含量变化

毛状根、侧根和水平根茎总黄酮含量的变化趋势相似，4—6月份，总黄酮含量呈快速上升趋势，均在6月份到达较高值，6—8月迅速下降，8月份几乎达到最低值。8—10月，总黄酮含量再次上升，9、10月达到高峰后又逐渐下降，呈双峰曲线。主根和垂直根茎总黄酮含量的变化趋势与毛状根、侧根和水平根茎有显著差异，主根在6月和10月分别有2个较高值，为2．42％和1．59％。

结合图1和图2可以看出，2年生栽培光果甘草各器官总黄酮含量上部叶＞中部叶＞毛状根＞水平根茎＞侧根＞主根、垂直根茎、上部茎＞中部茎、下部茎。地上部分总黄酮变化趋势与地下部分相似，5—6、9、10月份总黄酮含量明显高于其他月份。

2．2．3 3年生栽培光果甘草总黄酮的动态变化

2．2．3．1 地上部位不同时期总黄酮的含量变化

图3表明，地上营养器官在5—8月不同月份，上部叶总黄酮含量均显著高于其他部位，且在8月份达到最高值：12．63％。5—8月，地上叶总黄酮含量呈上升趋势，8月后，总黄酮含量逐渐下降。中部茎和下部茎总黄酮含量最低，随月份变化不显著。3年生栽培光果甘草地上营养器官总黄酮含量的高低顺序为：上部叶＞中部叶＞上部茎＞中部茎、下部茎。

图3 3年生栽培光果甘草地上部位不同时期总黄酮含量变化

2．2．3．2 地下部位不同时期总黄酮的含量变化

由图4可知，水平根茎0～10cm总黄酮含量比水平根茎10～20cm略高。在4—10月份，地下营养器官总黄酮含量变化幅度均较大。其中水平根茎、侧根、主根和垂直根茎总黄酮含量的变化趋势相似，4—5、6月份，总黄酮含量呈快速上升趋势，水平根茎0～10cm、水平根茎10～20cm和侧根均在5月份到达最高值，分别为5．05％、4．37％、3．48％，而主根和垂直根茎在6月份到达最高值，分别为2．98％、2．62％。5、6月后，水平根茎、侧根、主根和垂直根茎总黄酮含量呈迅速下降趋势，8月份几乎达到最低值，9、10月总黄酮含量又呈上升趋势。毛状根总黄酮含量的变化趋势与其他地下营养器官有显著差异，5—6月，总黄酮含量逐渐下降至最低值3．17％，6—8月，含量迅速上升到最高4．54％，8—10月，总黄酮含量又逐渐下降。3年生栽培光果甘草地下营养器官总黄酮含量的高低顺序为：毛状根、水平根茎＞侧根＞主根＞垂直根茎。

图4 3年生栽培光果甘草地下部位不同时期总黄酮含量变化

结合图3和图4可以看出，3年生栽培光果甘草各器官总黄酮含量上部叶＞中部叶＞毛状根、水平根茎＞侧根＞主根＞垂直根茎、上部茎＞中部茎、下部茎。地上部分总黄酮变化趋势与地下部分相似，5—6、9、10月份总黄酮含量明显高于其他月份。

2．2．4 8年生栽培光果甘草总黄酮的含量变化

2．2．4．1 地上部位不同时期总黄酮的含量变化

由图5可知，地上营养器官在6—10月，上部叶总黄酮含量均显著高于其他部位，6月达最高值：12．41％。茎中总黄酮含量均较低，且随月份变化不显著。

2．2．4．2 地下部位不同时期总黄酮的含量变化

由图6可知，水平根茎、侧根、主根和垂直根茎的总黄酮含量均在4月份最高，分别为2．95％、3．17％、2．20％和2．02％，毛状根在6月份总黄酮含量最高（4．77％），显著高于其他地下营养器官。

图5 8年生光果甘草地上部位不同时期总黄酮含量变化

图6 8年生光果甘草地下部位不同时期总黄酮含量变化

4—10月份，地下营养器官总黄酮含量变化幅度均较大，其中主根和水平根茎总黄酮含量的变化趋势相似，在4月后，总黄酮含量均呈下降趋势。侧根在4—8月份，总黄酮含量快速下降，8—10月，含量再次上升。毛状根总黄酮含量在4—6月份上升，6—8月迅速下降，8—10月再次上升，呈双峰曲线。垂直根茎总黄酮含量的变化趋势与毛状根相反。

结合图5和图6可以看出，8年生光果甘草各器官总黄酮含量上部叶＞中部叶＞毛状根＞水平根茎＞侧根＞主根、垂直根茎、上部茎＞中部茎、下部茎。地上部分总黄酮变化趋势与地下部分相似，4、6月份总黄酮含量明显高于其他月份。

2．3 结论与讨论

（1）不同龄期栽培光果甘草总黄酮含量比较。本实验结果表明，不同采集时间，1～3年生栽培与8年生光果甘草地上营养器官总黄酮含量相差不大（表1、图1、图3和图5）；地下营养器官总黄酮含量为：3年生中最高（平均2．59％），2年生与8年生中次之，1年生中较低（平均为1．15％）（表1、图2、图4和图6），说明光果甘草总黄酮的含量是随地下营养器官的生长和增粗而增加，而每年由地面芽或地下芽形成的地上营养器官的总黄酮的含量并无龄期的差别。

（2）栽培光果甘草不同营养器官总黄酮的积累和分布特点。通过对不同龄期光果甘草营养器官总黄酮含量的进一步分析，发现叶中总黄酮含量在生长季节期内均高于其他部位，这与组织化学定位中观察到叶中总黄酮显色位置多、染色深相一致。光果甘草不同营养器官总黄酮含量高低顺序为：叶＞毛状根、水平根茎＞侧根、主根、垂直根茎＞茎。这与廖云海等（2010）认为的1年生栽培光果甘草中总黄酮含量：叶＞水平根茎＞主根＞茎的结论一致，也与李卫东等（2009）对乌拉尔甘草叶中总黄酮含量的研究结果相似。栽培光果甘草在地上、地下各有一个含量较高的部位，上部叶（嫩叶）和毛状根总黄酮含量均较高。赵则海等（2005）对乌拉尔甘草的研究认为，嫩叶和毛状根可能是产生黄酮类物质的主要器官。相关研究表明，黄酮类物质是植物经过光合作用产生的一大类化合物（张睿等，2003），起始于苯丙烷代谢途径（Brenda，2001），上部叶是植物主要的光合器官，因此，也可能是产生黄酮类物质的主要器官。本研究和前人的相关研究结果较为一致地证实了这一观点。光果甘草的黄酮类物质可能由地上叶合成，一部分在叶中积累，另一部分再由茎转运至水平根茎、侧根和主根，地下部分为储藏器官，水平根茎和侧根储藏量均大于主根。

因此可以认为，在总黄酮积累和分配过程中，植株存在2个转移和积累趋势：上部叶（嫩叶）和毛状根作为植株新陈代谢的旺盛部位，可能是产生黄酮类物质的主要器官，上部叶通过茎转移到成熟叶和地下营养器官；地下毛状根通过水平根茎、次级侧根分别向储藏器官主根、上级侧根逐步积累。

（3）不同龄期栽培光果甘草总黄酮的季节动态规律。在整个生长季节，2～3年生栽培光果甘草总黄酮含量的动态变化显著（图1、图2、图3、图4），且在5—6月、9—10月各营养器官均有较高的值。Natividad等（1998）对岩玫瑰（Cistus ladanifer）的研究表明，总黄酮含量在紫外辐射强的夏季比紫外辐射弱的春季高2～3倍。较低的温度也有利于总黄酮的积累（吴菊兰等，2009；谢毛成等，2003）。孙明君等（1997）对我国7个省份的大豆进行异黄酮含量测定，结果显示随着自南向北、自东向西降水量逐渐减少，异黄酮含量逐渐增加。2年生栽培光果甘草上部叶总黄酮含量在6月份有一个高峰值，可能与6月的强辐射相关，但伴随着7—8月高温的到来，总黄酮含量下降；9—10月温度逐渐下降，总黄酮含量上升，到10月增加到最大值11．76％。当然，黄酮类化合物含量高低是植物自身的遗传因素、植物生长发育进程、生境条件的综合反映（冯定霞等，2003）。本研究结果中栽培光果甘草总黄酮含量在整个生长季节中有较大幅度波动的现象，应是多种因素的综合，具体原因尚有待进一步的深入研究。

（4）光果甘草在传统用药中，通常生长3～4年后在秋季采挖地下根及水平根茎作为药材的主要来源，忽略了地上营养器官的药用价值。2～3年生栽培光果甘草上部叶在6、10月份总黄酮含量均大于11％，达到且远远超过药典标准（国家药典委员会，2005）。考虑到6月份正值植株的旺盛生长期，采收地上营养器官对植株生长有影响，人工栽培光果甘草的最佳采挖季节在早秋（9—10月）较合适，地上部分叶也可以进行采收利用，可大大提高栽培光果甘草药用成分的利用率。同时，野生光果甘草可以每年在9—10月份只采收地上部分，保护地下根系，这样既充分利用了野生资源，又不破坏生态环境，实现经济价值和生态价值的双赢。本研究结果为综合利用栽培光果甘草和保护、利用野生药用甘草提供了新思路。

3 光果甘草甘草酸消长规律的研究

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

1、2、3年生栽培光果甘草（Glycyrrhiza glabra L．）和8年生光果甘草，取样方法及材料同2．1．1。

3．1．2 甘草酸的含量方法

3．1．2．1 仪器与试剂

KQ－50R型超声波提取器（昆山市超声仪器有限公司），BS423S电子天平（德国Sartorius公司），高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；甘草酸单铵盐（090708）购于上海融禾医药科技发展有限公司。

甲醇、冰醋酸、异丙醇等试剂均为色谱纯，双蒸水，0．45μm水系滤膜，1．5m L进样瓶。流动相的配比为色谱甲醇∶水∶36％冰醋酸＝71∶28∶1。

3．1．2．2 标准曲线的配制

精确称取甘草酸单铵盐标准品3mg，加3m L色谱甲醇，混匀，浓度为1mg／m L，作为标准品储藏液，分别精确吸取50μL、100μL、200μL、400μL、500μL标准品储藏液，然后用流动相定容至1m L，其浓度分别为50μg／m L、100μg／m L、200μg／m L、400μg／m L、500μg／m L。在波长254nm处，高效液相色谱仪测定峰面积，根据峰面积可计算出标准曲线：Y＝4．996 4 X－7．866，R2＝0．999 9。

3．1．2．3 甘草酸的提取与含量测定

精密称取样品粉末50mg于10m L离心管中，每个样品重复处理2次，加流动相3m L，浸泡24h后，常温下超声提取30min后静置24h，取上清液，再往滤液中加2m L流动相，常温下超声提取30min，静置24h后取其上清液与第一次的上清液混匀。0．45μm水系膜将混合液依次过滤于安捷伦进样瓶中编号待测。

以色谱甲醇∶水∶36％冰乙酸（色谱纯）＝71∶28∶1为流动相，进样量为5μL，流速1m L／min，柱温30℃，波长254nm处进行甘草酸的液相色谱测定，记录各样品中甘草酸的峰面积。根据外标峰面积和标准曲线法计算甘草酸含量。

3．2 结果与分析

3．2．1 1年生栽培光果甘草甘草酸的含量变化

如表3所示，甘草酸主要存在地下营养器官中，地上痕量或无。11月温度下降后，主根和根茎中甘草酸含量呈上升趋势。1年生栽培光果甘草甘草酸含量最高为水平根茎，主根次之，侧根和垂直根茎中含量最低。

表3 1年生栽培光果甘草不同时期甘草酸含量

3．2．2 2年生栽培光果甘草甘草酸的动态变化

由图7可见，2年生栽培光果甘草地下营养器官甘草酸含量的高低顺序为：主根、侧根、水平根茎＞垂直根茎。4—11月份，主根、侧根、水平根茎甘草酸含量的变化趋势相似，5—6、7月份，甘草酸含量呈快速上升趋势，主根和侧根均在6月份到达最高值，分别为1．60％、1．43％，而水平根茎在7月到达最高值1．50％，6、7月后，甘草酸含量呈快速下降趋势，9月，甘草酸含量再次上升，10月后，又逐渐下降。垂直根茎甘草酸含量的变化趋势与其他地下营养器官相反，5—7月，甘草酸含量呈快速下降趋势，7月到达最低值0．59％，7月后甘草酸含量呈逐渐上升趋势。

3．2．3 3年生栽培光果甘草甘草酸的动态变化

由图8可知，3年生栽培光果甘草地下营养器官甘草酸含量的高低顺序为：水平根茎（0～10cm）＞主根、侧根、水平根茎（10～20cm）＞垂直根茎。4—10月份，水平根茎、主根、侧根甘草酸含量的变化趋势相似，4—6月，甘草酸含量呈快速上升趋势，6月份均到达最大值，分别为3．38％、2．94％、2．67％、3．08％。6月后甘草酸含量呈快速下降趋势，9、10月份含量再次上升。垂直根茎甘草酸含量的变化趋势较小，呈双峰曲线，4—5月甘草酸含量逐渐上升；5—7月逐渐下降；8—9月甘草酸含量再次上升；9月后呈下降趋势。

图7 2年生栽培光果甘草不同时期甘草酸含量变化

图8 3年生栽培光果甘草不同时期甘草酸含量变化

3．2．4 8年生栽培光果甘草甘草酸的动态变化

由图9可知，8年生光果甘草地下营养器官甘草酸含量的高低顺序为：侧根＞主根＞水平根茎＞垂直根茎。4—10月份，侧根、主根和水平根茎甘草酸含量的变化趋势相似， 4—6月，甘草酸含量呈快速上升趋势，6月份均到达最大值，分别为1．98％、1．71％、1．20％，6—10月，甘草酸含量呈下降趋势。垂直根茎甘草酸含量的变化趋势与其他地下营养器官相反，4—6月甘草酸含量下降，6—8月甘草酸含量呈上升趋势，9—10月含量逐渐下降。

图9 8年生光果甘草不同时期甘草酸含量变化

3．3 结论与讨论

（1）不同龄期栽培光果甘草甘草酸含量比较。3年生最高，8年生和2年生次之，1年生最低（表2、图7、图8、图9），说明人工栽培的光果甘草甘草酸积累主要在1～3、4年，超过4年以上甘草酸的积累趋于缓慢；另外，4年以上（8年生）光果甘草甘草酸含量比3年生低，可能与储存和积累甘草酸的组织细胞比例减少有关。随着龄期的增加，韧皮纤维束环数增多，纤维性增强，木质部中导管较多，木质化程度强，韧皮部和木质部的薄壁细胞相对减少。本研究组织化学定位中观察到甘草酸主要积累分布于根的周皮、韧皮部和木质部的薄壁细胞、射线细胞中，8年生栽培光果甘草木质化程度增加，薄壁细胞比例减少，因此甘草酸含量亦减少。本研究结论与前人对乌拉尔甘草研究得出的结果相似（刘金荣等， 2004a，2004b；彭励等，2006a，2006b）。

（2）栽培光果甘草不同营养器官甘草酸的积累和分布特点。通过对不同龄期光果甘草营养器官甘草酸含量的进一步分析，光果甘草地上部分甘草酸含量为痕量或无，主要分布在地下营养器官中，这与组织化学定位中观察到结果相一致。但不同龄期地下营养器官中的分布和积累规律存在差异：1年生栽培光果甘草地下营养器官甘草酸含量高低顺序为：水平根茎＞主根＞侧根＞垂直根茎；2年生为：主根＞侧根＞水平根茎＞垂直根茎；8年生为：侧根＞主根＞水平根茎＞垂直根茎。不同龄期栽培光果甘草垂直根茎含量均为最低，说明垂直根茎不是甘草酸的主要储藏器官，这与赵则海等（2005）对野生乌拉尔甘草的研究相似；通过对甘草酸代谢途径的分析：光合作用产物→乙酰辅酶A→甲羟戊酸→角鲨烯→香树脂醇→甘草酸（Hayashi et al．，2001），说明甘草酸可能是由地上部分光合作用后经过一系列的生化反应而产生的。1年生栽培光果甘草水平根茎甘草酸含量高可能与其植株的生长，尤其是根系发育阶段相关，由地上部分产生的甘草酸的一系列前体通过茎首先在距离地上器官最近的水平根茎中大量分布、积累，然后再通过垂直根茎依次运输到距离较远的主根、侧根中。而1年生栽培光果甘草由于主根发育较细、侧根较少，其储存甘草酸的“库”容量相对较小，所以其甘草酸含量相应较低。随着龄期的增加，主根和侧根增粗，“库”容量逐渐增大，而水平根茎每年生长时，芽的萌发和地上结构的生长需要消耗大量的能量，与逐渐发育增粗的主根和侧根相比，其“库”容量相对变小，所以大于2年生的栽培、野生光果甘草甘草酸往往主要在主根、侧根积累，即甘草酸分布和积累部位呈现由水平根茎到主根、侧根逐渐转移的趋势。

（3）不同龄期栽培光果甘草甘草酸的季节动态规律。在一个生长季节中，不同龄期栽培光果甘草甘草酸含量的动态变化呈现相似的变化规律，即从4—6、7月，甘草酸含量呈上升趋势，6、7月达到最高值，7—8月甘草酸含量下降，9、10月含量再次上升（8年生甘草除外）。这与王巧娥等（2004）对8年生乌拉尔甘草甘草酸含量在6—7月份最高的结论相似；刘长利等（2008）也发现夏季采收的乌拉尔甘草中甘草酸含量高于春秋季。而赵则海等（2005）则认为栽培乌拉尔甘草地下营养器官的甘草酸含量在10月份最高，这可能与生产区的环境、土壤等因素相关。

4 栽培光果甘草药材资源综合利用建议

4．1 不同龄期栽培光果甘草采收总黄酮的含量比较

根据2．2总黄酮消长规律的分析，栽培光果甘草在6、9—10月份总黄酮含量较高，应为合适的采收期；叶、主根、侧根和毛状根为主要积累器官，故重点对不同龄期栽培光果甘草叶、主根、侧根和毛状根的6、10月份总黄酮含量进行了比较。

如图10所示，2、3年生栽培光果甘草在6、10月采收期的总黄酮含量比较显示，6月采收的药材，除毛状根、叶外，侧根、主根均大于10月采收期，8年生栽培光果甘草6月高于10月。不同龄期比较结果表明差异不显著：3年生略高于8年生、2年生；同一龄期不同采收部位总黄酮含量存在显著差异：叶中最高，均已超过9％（8年生栽培光果甘草10月的除外），毛状根其次，为4％左右，其余部位为2％～3％。

4．2 不同龄期栽培光果甘草采收部位甘草酸的含量比较

根据3．2甘草酸消长规律的分析，栽培光果甘草在6—7月份甘草酸含量较高，应为合适的采收期；主根、侧根为主要积累器官，故重点对不同龄期栽培光果甘草主根、侧根的6月份甘草酸含量进行了比较。

图10 不同龄期栽培光果甘草采收期总黄酮含量的比较

如图11所示，不同龄期栽培光果甘草甘草酸含量存在显著差异：3年生中最高，约为3％，8年生中次之，2年生中最少，约为1．5％；不同龄期不同采收部位甘草酸含量不同：2、3年生中主根＞侧根，而8年生中为侧根＞主根。

图11 不同龄期栽培光果甘草采收期甘草酸含量的比较

4．3 结论与建议

以总黄酮为采收目的时，2、3年生和8年生的栽培光果甘草总黄酮含量均已达到药典标准，但适宜采收部位和采收时间有差异，生长年限少的（2～3年）在6、10月采挖适宜，而生长年限长的最佳采收期为6月，采收部位可以是全株；以甘草酸为采收目的时，大于3年生栽培光果甘草的主根、侧根甘草酸达到药典标准（2％以上），最佳采收期为6月，但栽培年限过长，主根和侧根甘草酸均有下降趋势，故不提倡栽培年限太长。

综合以上两种药材成分，栽培光果甘草大于3年生（包括3年生）就可以进行药材的采挖，最佳采收期为6月，可同时采收地上、地下部位，达到综合利用的目的，但不提倡采收栽培年限太长的药材。另外，对小于3年生的栽培光果甘草，每年地上部分的叶和茎可以在9—10月植株生长趋于减弱、进入冬季休眠前进行收获，也可以增加收益。

李娜 陆嘉惠 李学禹

囯家自然科学基金项目：30760028