甘草属植物的分类系统与实验生物学研究

摘 要：应用RAPD技术，探讨甘草属（Glycyrrhiza L．）13种及1变种30个植物类群的遗传差异和几个争议种的分类地位。从60个随机引物中筛选出14个多态性好的引物进行RAPD实验，DNA片段的二态数据用UPGMA聚类法构建系统发育树。共扩增出250条带，多态性带204条，约占总数的81．7％。聚类结果显示RAPD分子标记构建的系统发育树与经典分类系统一致。甘草属植物具有丰富的遗传多样性，同种内不同居群间的遗传分化较大。黄甘草、胀果甘草、乌拉尔甘草三者亲缘关系较近，平卧甘草与粗毛甘草存在很大的遗传差异，作为独立种较合理。RAPD标记可为甘草属植物的系统分类研究提供分子生物学依据。

关键词：甘草属；RAPD；遗传多样性；分类

豆科（Leguminosae）甘草属（Glycyrrhiza L．）植物全世界约20种（李学禹，1993）。《中国植物志》记载中国分布8种甘草（崔鸿宾等，1998），其中药用甘草3种。研究表明，甘草次酸类化合物除了用于防治病毒性肝炎、高血脂外，对抗癌、细胞免疫、抑制艾滋病病毒（HIV）增殖有作用（彭子模，1998）。由于该属植物种内、种间遗传变异复杂，属下种的亲缘关系和分类鉴定一直存在争议，给甘草属植物资源的研究带来混乱。近年来发展起来的RAPD技术已成功地应用于多种药用植物的遗传多样性研究和分类鉴定（肖小河等，2000；祁建民等， 2003）。RAPD技术在甘草属植物的研究，国外有少量报道，但仅限于少数几种甘草属植物的研究（Yamazak et al．，1994；Hayashi et al．，1998），国内王鸣刚等（2004）曾对甘草属3种甘草（G．uralensis Fisch．，G．inflata Bat．，G．glabra L．）的亲缘关系进行RAPD分析。本研究系统、全面地探讨了甘草属13种及1变种30个类群在RAPD指纹图谱上的遗传差异和种间亲缘关系，澄清了一些争议种的分类地位；同时对RAPD技术在甘草属植物分类鉴定应用的可行性进行了探索，为甘草属植物系统学研究提供分子生物学依据。

1 材料与方法

1．1 材料

分别来自石河子大学甘草研究所甘草资源圃和石河子郊区野生甘草，部分取自标本室腊叶标本，由石河子大学李学禹教授鉴定。实验编号、名称、采集地及凭证标本号见表1。

表1 实验材料来源及采集地

1．2 方法

1．2．1 DNA提取及纯化

核DNA提取法参见文献（邹喻萍等，2001），并做改良。液氮研磨时加入PVP干粉， CTAB含量提高到3％，水浴时间调整到1h，所得DNA粗提物经RNAase（10mg／L） 37℃保温1h，乙醇沉淀后溶于50μL TE，分别经0．8％琼脂糖凝胶电泳（EB 0．5μg／m L）和0．1TE稀释后低温（－20℃）保存备用。

1．2．2 基因组DNA检测

0．8％琼脂糖凝胶（EB 0．5μg／m L），4V／cm稳压电泳（0．5TBE），40min后于紫外分光光度下观察其纯度并判别DNA分子的大小和含量。

1．2．3 RAPD反应体系建立

RAPD反应体系的PCR反应缓冲液、d NTP、Taq酶购自北京华美生物公司。分别对Mg2＋浓度、引物浓度、模板浓度、酶含量、d NTP含量设置了不同梯度组合，进行PCR扩增，确立甘草属植物最适的反应体系为Mg2＋2．5mmol／L，d NTP 100～200mmol／L，Taq酶0．5～0．6U／10μL，引物5pmol／L，模板DNA 5～30ng。

1．2．4 基因组DNA扩增及检测

RAPD反应程序参照文献（邹喻萍等，2001）的方法，PCR产物在1．4％琼脂糖凝胶（EB 0．5μg／m L），3V／cm稳压电泳1．5～3h，紫外透射仪观察，Deldoc－2000凝胶成像系统照相。

1．2．5 引物筛选

对美国Operon公司生产的60组随机引物进行筛选，多态性带的选择以DNA扩增片段至少在1个种出现，且在其他种至少有1个不出现为准。

1．2．6 RAPD指纹图谱的数据处理

对扩增产物选取条带清晰，重复性好的进行记录，每个样品的扩增带按有或无记录。“有”赋值为1，“无”赋值为0。原始数据矩阵输入NTSYS 3．0，根据Nei和Ni的方法计算样品间的简单遗传相似系数，按非加权算术平均数聚类（UPGMA）方法构建RAPD聚类图。

2 结果与分析

2．1 引物筛选和扩增结果

60组随机引物中，有8个引物无扩增带或扩增带不清晰，38个引物有扩增带，但有的重复性不好，稳定性差，有的扩增带清晰，但无多态性，14个引物均能扩增出清晰、重复性好的多态性带。共扩增出250条带，其中多态性带有204条，约占总数的81．7％，平均每个引物15．2条，表现出丰富的遗传多样性。所用引物序列和扩增情况见表2。由表2可知，不同引物的扩增片段和扩增多态性程度不同，OPR－08、OPR－16达100％，这2个引物适用于进一步对甘草属的遗传多样性的研究。

表2 所用引物序列及扩增情况

续 表

2．2 聚类结果分析

2．2．1 种间遗传关系的分析

用Nei方法计算得到的相似系数矩阵，经非加权算术平均数聚类（UPGMA）方法建立甘草属植物RAPD聚类图（图1）。根据图1，结合线L1将30个类群划分为3组：｛28、29、30｝，｛14—27｝，｛1—13｝。第一组中云南甘草与圆果甘草亲缘关系较近，与刺果甘草亲缘关系较远；第二组为粗毛甘草和光果甘草类群，二者有较近的亲缘关系；第三组为乌拉尔甘草、胀果甘草、无腺毛甘草、黄甘草，都为长荚果类群，这与基于形态学的数值分类结果是一致的。结合线L2为分种的界限，种间的平均相似性系数为0．72，显示了甘草属种间的遗传分化程度。在此结合线下，甘草属的几个传统种（粗毛甘草、光果甘草、乌拉尔甘草、胀果甘草）都被分出。

图1 基于RAPD数据的甘草属植物遗传分化聚类图

2．2．2 种内遗传关系的分析(www.xing528.com)

乌拉尔甘草不同居群间的相似性系数为0．69～0．86，存在较大的遗传差异，这与乌拉尔甘草在形态上的多型性是一致的。聚类结果显示新疆境内的居群与境外居群间的遗传分化明显，各聚为一支，说明乌拉尔甘草不同居群存在与地理分布和环境相关的遗传差异，是广布的多型种，这也为不同产地乌拉尔甘草在化学成分差异的相关性提供了分子遗传基础。无腺毛甘草与乌拉尔甘草的相似性系数为0．77，有较近的亲缘关系。

黄甘草是甘草属有争议的种。张鹏云等（1960）认为黄甘草是胀果甘草与乌拉尔甘草的天然杂交种，而1988年《亚洲中部植物》第八册第一分册作为胀果甘草的异名处理（杨昌友，1999）。RAPD聚类结果显示黄甘草与胀果甘草先聚为一支，再与乌拉尔甘草各类群聚为一大支，这3个种的遗传关系较近。RAPD指纹图谱显示，黄甘草在OPF－06的600bp（图2）、OPR－16的300bp（图3）位点上带的缺失介于胀果甘草和乌拉尔甘草之间，有杂交种的可能。

图2 引物OPF－06扩增的RAPD图谱

泳道1、2黄甘草；泳道3、4胀果甘草；

泳道5—11乌拉尔甘草；泳道M1

PCR分子量标记（100bp～2kb）

图3 引物OPF－16扩增的RAPD图谱

泳道M2DNA分子量标记λDNA／Eco RⅠ＋HindⅢ；

泳道1、2黄甘草；泳道3、4胀果甘草；

泳道5—11乌拉尔甘草

蜜腺甘草在荚果形态上存在从果光至果糙的连续变异类型，介于乌拉尔甘草与光果甘草之间。聚类结果显示与光果甘草亲缘关系较近。最近研究发现，乌拉尔甘草与光果甘草的一种特异化合物存在于这两种的中间类型甘草中，是两种甘草的杂交种（Hayashi et al．， 2003）。因此，对蜜腺甘草的遗传背景和连续变异类型化学成分的研究值得探讨和研究。

粗毛甘草不同类群的遗传分化较大，平卧甘草曾被归并为粗毛甘草，但聚类结果显示了平卧甘草从粗毛甘草的类群分出，单独聚为一支，显示其与粗毛甘草的遗传差异已达到分种水平，将之归并为粗毛甘草是不合理的。粗毛甘草其他的类群中在种下的遗传分化也较强，但多为种内变异范围。

3 讨论

3．1 RAPD技术在甘草属植物系统分类的应用

在本研究中，基于RAPD图谱建立的树系图结果表明，种间、种内的遗传关系与经典分类学有较好的一致性，因此，RAPD技术在甘草属分类学和遗传多样性研究中具有较大的应用潜力。另外，RAPD技术在杂交体系的研究中也具有一定潜力。Smith采用RAPD技术，根据杂交种与待定双亲的共有带、与亲本的共有带、杂种的特有带记录，进行杂交种的鉴定，最后的RAPD资料证明推断杂种确实是杂交起源。因此，对本研究中蜜腺甘草、黄甘草杂交种的分类地位，可应用RAPD技术进一步研究，将筛选出RAPD特征带作为杂交探针来检测RAPD产物在DNA印迹上的同源性，并推断是否是杂交起源。

3．2 几个有争议种的分类地位探讨

3．2．1 蜜腺甘草的分类地位

对疑难种的鉴定，人工杂交试验往往可以获得有用的证据，杂交一般只能产生介于和分享两亲本群体的特征和占据中间性生境的中间性群体。张新玲等（1998）杂交试验结果显示了光果甘草与乌拉尔甘草的杂种一代在荚果的形态和被腺毛情况与蜜腺甘草极为相似；蜜腺甘草在叶表皮细胞形态上也是介于光果甘草与乌拉尔甘草间的微波状（陆嘉惠等，2005）。从RAPD图谱扩增带的分析也有迹象显示了蜜腺甘草的中间型，杨继（1991）认为，变种可以是地理、生态、细胞或三方面的组合，有时也可以用于那些本质还不清楚的变异体。因此，结合比较形态、杂交试验，支持将蜜腺甘草作为变种处理。

3．2．2 黄甘草的分类地位

RAPD聚类分析和图谱说明黄甘草与胀果甘草遗传差异较大，将其归并胀果甘草是不合理的，将会掩盖其特有的遗传背景，失去有价值的性状。在自然生境中，黄甘草与胀果甘草、乌拉尔甘草形态性状有交叉，分布区也有重叠，化学成分谱带也显示介于两者之间（马淼，1997）。在叶表皮形态（陆嘉惠等，2005）、核型、等位酶、杂交试验分析中，黄甘草为较进化类型，具有丰富的遗传多样性，与胀果甘草、乌拉尔甘草杂交亲和指数高，暗示有杂种优势（马淼，1997）。因此，结合RAPD分析、比较形态、细胞核型、杂交试验的结果，同意张鹏云（1960）认为黄甘草是胀果甘草与乌拉尔甘草的杂交种的观点。

3．2．3 平卧甘草的分类地位

平卧甘草与粗毛甘草的主要区别是：茎平卧，叶小，被蜡质，萼光、红、长裂齿短，龙骨瓣黄色，荚果窄细。在种皮结构形态上，平卧甘草脐晕为倒置的长颈瓶状，而粗毛甘草脐晕不明显，为狭长的倒三角状；在形态结构上，平卧甘草外形和内部结构都具有旱生特性，在野外调查中，发现其与其他粗毛甘草类群混生，但在叶表面具有“白霜”，即蜡质，即使在近水渠边，长势好的叶表面也没有失去这一特征，这说明蜡质的存在已不是简单的环境饰变，已形成不随环境变化的稳定遗传性状，有质的区别；叶表皮气孔类型上也显示了与粗毛甘草种内其他类群有较大的差异，具有较进化的特征（陆嘉惠等，2005）；在地理分布上，不仅石河子有，哈密、吉木乃、霍城也有；RAPD聚类分析也支持上升为种的地位。因此，平卧甘草有可能是由粗毛甘草中抗旱类群在长期进化过程中分化出的一支，作为种处理较合适。

陆嘉惠 李学禹 马淼 阎平

国家科技部新疆生产建设兵团攻关专项课题：2001EP050012

石河子大学自然科学基金项目：200310

第七届全国系统与进化植物学青年学术研讨会报告并收录论文汇编，2002

中国植物学会七十周年年会论文摘要汇编，2003，高等教育出版社，44

发表于《西北植物学报》，2006，26（3）：527－531