甘草属（GlycyrrhizaL.）的分类与生物学研究

摘 要：对中国甘草属植物应用幼苗发育与等位酶数据研究中国甘草属植物的系统演化。甘草属有3种类型的幼苗：①G．pallidiflora与G．yunnanensis在子叶后仅形成1个单叶，然后发育出3～4个三出羽状复叶；②G．alalensis、G．inflata与G．glabra在子叶后形成2～4个单叶，然后发育出三出羽状复叶；③G．korshinskyi、G．uralensis、G．eglandulosa、G．macrophyll在子叶后形成2～4个单叶和G．laxiflora、G．aspera、G．prostrata在子叶后形成5或5个以上单叶，并且有一些种仍未发育出复叶。等位酶研究显示：（1）玛纳斯河流域是中国甘草属遗传多样性最丰富的地区，并且是一个甘草属的“次生演化中心”；（2）一半以上的种间具有很高的遗传相似性，使根据等位酶资料进行属下划分很困难；（3）在中国有一条甘草属从东向西的演化路线；（4）G．yunnanensis是一个较独特的种，本种与其他的种之间的遗传一致度较低，且分布在与其余种完全隔离的中国西南部，本种可能存在一条独特的进入中国的演化路线。

关键词：甘草属；等位酶；幼苗；遗传一致度；遗传多样性；中国

甘草属植物一共有21种，按新分类系统（李学禹，1987，1989，1993），将其划分成2组5系。其中，中国产18种，除G．squamulosa之外，其余均属于甘草组的3个系：短荚果系、长荚果系、念珠状荚果系。在中国产甘草属中，G．squamulosa、G．triphylla已多年未见生活植物体。Григорьев等（1948）从系统发育的观点，认为幼年植物在属的范围内结构的多样性是它们系统发育的不同途径造成的。甘草属植物的幼苗与其成年植株在形态上存在着区别，并且不同种的幼苗形态也存在着区别，正反映出甘草属各个种的系统发育途径的不同。

用同工酶来分析遗传多样性，是因为可将同工酶作为识别基因位点和等位基因的媒介，即作为一种遗传标记。等位基因酶就是一种十分有效的遗传标记。Prakash等（1969）提出了把同一基因位点的不同等位基因所编码的一种酶的不同形式叫做“等位酶”（allozyme），把它从广义的同工酶的概念中分了出来（王中仁，1994）。通过分析一批等位酶位点上等位基因数目和频率的变化，可以推断植物居群或类群的遗传变异的高低、时空变化以及居群或类群间的遗传关系，通常称此类分析为等位酶分析（葛颂，1994b）。由于等位酶的变化所反映的是遗传物质在分子水平上的变异，所以等位酶技术是一种分子系统学方法。据此，我们用等位酶方法来分析甘草属的遗传多样性，进行甘草属的系统演化研究。

1 材料与方法

1．1 幼苗研究

对中国产16种甘草属植物的种子，经浓硫酸处理0．5h以后，在花盆中栽培，保持温度20±2℃，观察幼苗发育过程。

1．2 同工酶研究

实验材料采自中国产甘草属植物14种1变种的28个天然居群的种子，将各个居群种子分别混匀，然后各随机抽取一部分种子，经浓硫酸处理20min后，经24℃恒温光照培养5d，每个居群取5～27对绿色、展开的子叶，作为实验材料（表1）。

表1 中国甘草属植物等位酶分析材料

将每对子叶置于提取液中冰上研磨。采用简单磷酸提取液（Wendel＆Weeden，1989；王中仁，1994）略作改动：磷酸缓冲液（p H7．4）10m L，加0．5g PVP（5％），加5μL巯基乙醇（0．1％）。将材料和提取液置冰上比色盘坑中用小玻璃试管研磨成匀浆，将芯子置于其中浸润。采用水平淀粉凝胶电泳，凝胶板容量为250m L，规格为230mm×180mm×6mm，每板安置样品28～32个。经大量预备实验筛选出一种凝胶系统（Soltis et al．，1983）。

电泳缓冲液：117．6g柠檬酸＋H2O 1 000m L，用1mol／L HCl调p H至7．0。

凝胶缓冲液：1．8g盐酸组氨酸＋20g蔗糖＋H2O 1 000m L，用1mol／L HCl调p H至7．0。

采用250V稳压电源，整个电泳过程在4℃的玻璃门冰箱中进行。待溴粉蓝前沿移至距起点12cm左右时，停止电泳，将凝胶取出，水平切割成4块，分别放入4个染色盒中染色（Wendel ＆Weeden，1989）。

在供试材料中，检测了12种酶系统，仅有4种酶系统可得到分离好的谱带（表2）。等位酶位点和等位基因的命名依照常规，以酶的缩写字母代表该酶系统，连字符后数字代表该酶不同的位点，愈靠近正极（迁移率越大）的位点以愈小数字表示。每个位点的等位基因用小写英文字母代表，靠正极最近的以a表示，其次以b表示，依次类推。

表2 中国甘草属植物等位酶分析所用的4种酶系统

采用下列几个指标进行遗传分析：多态位点百分率（P）；等位基因平均数（A）；平均期望杂合度（He）；固定指数（F）；基因分化系数（Gst）；遗传一致度（I）。这些参数的意义和计算方法参阅有关文献（Nei，1972，1973，1978；Gottlieb，1981；Brown ＆Weir，1983；葛颂，1989b）。部分计算过程使用及参考BIOSYS－1程序（Swofford ＆Selander，1989）。

2 结果

2．1 幼苗发育

16种中观察到12种的幼苗发育过程，另外，G．shiheziensis、G．eurycarpa、G． nutantiflora、G．purpureiflora4个种中未能观察到其幼苗发育过程。

在甘草属12种植物幼苗发育过程中可发现一致性的地方。首先是所有观察到的种，在其子叶到形成成年植株的复叶类型之间，均先发育出单叶，并且在单叶之后，发育出3出羽状复叶。其次，甘草属所有种的幼苗的单叶形状的大都为圆形、心形、阔心形、扁圆形，其先端大都钝、圆或凹。

种间的区别也是很明显的，从单叶数目上看，G．pallidiflora与G．yunnanensis的幼苗生长出一片单叶之后，形成2～4个3出羽状复叶；G．alalensis在形成2～3片单叶后，G．glabra及G．inflata在具3～4片单叶后，G．uralensis在具5～7片单叶后，G． laxiflora在具6～7片单叶后，形成3出羽状复叶；而G．eglandulosa在具5片单叶后， G．korshinskyi在具6片单叶后，G．prostrata在具7片单叶后，G．macrophylla在具5片单叶后，G．aspera在具6片单叶时，仍未生长出3出羽状复叶。

居群遗传结构各居群的等位基因平均数（A）、多态位点比率（P）、平均期望杂合度（He）、固定指数（F）见表3。

表3 中国甘草属28个居群的遗传多样性指标

＊指直接观察到的杂合度。

幼苗不同的形态代表着不同的系统发育的途径，据此，可以将甘草属划分为3种类型。

类型一。包括G．pallidiflora与G．yunnanensis。均形成一个单叶，这两个种生出的3出羽状复叶都较大，侧小叶的叶型都接近成年植株，只不过G．yunnanensis的顶小叶为椭圆形，先端渐尖，而G．pallidiflora的顶小叶为倒梨形，先端平、钝、甚至凹。

类型二。包括G．alalensis、G．inflata、G．glabra。均形成2～4单叶，从叶形上看前两者幼苗的单叶大多为阔心形，且G．inflata更阔些，先端多凹，而G．glabra较为独特，其幼苗的小单叶在所有观察到的种中最小、最圆。(www.xing528.com)

类型三。包括G．korshinskyi、G．uralensis、G．eglandulosa、G．macrophylla、G． laxiflora、G．aspera、G．prostrata，均形成5片单叶及5片以上。

类型一的两个种属于短荚果系；类型二的3个种属于长荚果系，这3个种的荚果均膨胀；类型三的7个种的荚果种子间均有不同程度的缢缩。可见，荚果的形态在甘草属中具有重要的分类意义。新分类系统将荚果性状作为甘草组系的划分的主要依据是有其合理性的。

2．2 等位酶分析

（1）天冬氨酸转氨酶：该酶又被称为谷氨酸草酰乙酸转氨酶，为二聚体结构，在甘草属植物当中，可检测出3个位点。其中AAT－2因与AAT－1、AAT－3重叠，无法分析。AAT－1与AAT－3分别由4和2个等位基因。

（2）苹果酸脱氢酶：该酶也是二聚体酶，在甘草属中，可检测出3个位点，由于MDH－1与MDH－2重叠难以分析，故只利用MDH－3，这个位点有2个等位基因。

（3）磷酸葡萄糖变位酶：该酶是一种单聚体酶，在甘草属植物中检测出2个位点， PGM－1有2个等位基因，而PGM－2则有5个等位基因。

（4）6－磷酸葡糖酸脱氢酶：该酶是一种二聚体酶，在甘草属植物中检测出2个位点，其中6－PGD－1为单态，即只有一个等位基因，而6－PGD－2则有2个等位基因。

变化范围A值：1．143～2；P值：14．3％～71．4％；He值：0．035～0．344；F值：－0．505～0．951。G．aspera、G．purpureiflora、G．prostrata、G．macrophylla这4个种的居群有较高的A、P、He值，形态上均为长荚果念珠状类，属念珠状荚果系；G． pallidiflora、G．yunnanensis的居群有较低的A、P、He值，形态上均为短荚果类，属短荚果系。两个分布最为广泛的种G．uralensis、G．glabra，其居群间的A、P、He值变化很大。

无论在种内还是在种间，分布于石河子地区的居群，其A、P、He值均较高，即遗传多样性较为丰富。本地区已成为中国甘草属基因最为丰富的地区。

固定指数（F）反映的是居群偏离平衡的程度，当F＞0时，杂合体过量；反之，纯合体过量。甘草属的大部分居群都处在严重偏离平衡的状态。

基因分化系数（Gst值）为0．428，种间的遗传一致度（I）见表4。种间I平均值为0．812。根据种间遗传一致度进行聚类，结果如图1。

表4 种间遗传一致度（Nei，1972）

种内居群间的I平均为：G．alalensis：0．969；G．inflata：0．918；G．eglandulosa：0．9709；G．uralensis：0．8956；G．glabra：0．981。

图1 聚类图（遗传—致度，UPGMA）

3 讨论

影响居群遗传变异大小的主要因素为繁育系统与分布范围（Hamrick ＆Godt，1990；葛颂，1994b）。以自交为主或分布范围窄的居群，遗传变异较小；以异交为主或分布范围广的居群，遗传变异较大。G．aspera、G．purpureiflora、G．prostrata、G．macrophylla这4个种在形态上有与异交相适应的特征，这一类群的植物在甘草属中与花有关的各性状值最大。而在中国甘草属中花最小的G．pallidiflora、G．yunnanensis，其居群不丰富的遗传变异在于其存在着较大程度的自交与近交。

玛纳斯河流域（石河子地区）最丰富的基因多样性，不仅表现在不同种间，同时也表现在同一种内不同居群间，即出现了遗传多样性与居群原产地的关系更近于居群的分类关系（Loos，1993）。由于本地区是中国种类最丰富的地区，因而这一地区已成为中国境内的一个甘草属的“次生演化中心”。另一方面，也表明在本地区存在着一定程度的种间杂交。

关于同属内不同种间遗传一致度，一般认为平均为0．67，而同种不同居群之间的遗传一致度一般认为大于0．90。本属同种间不同居群间的I值与此基本吻合。但广泛分布的G．uralensis的居群间的I值为0．8956，说明本种较古老，目前居群间分化较为强烈。而同为分布广泛的种G．glabra的居群相似性则较高，则表明本种处于较低的分化状态。但种间的I值平均为0．812，高于0．67，实际上，不符合0．67这种情况也有很多报道（Cosner ＆Crawford，1990）。对于这种情况的解释，一般认为与影响植物居群遗传结构及其变异的因素很多且复杂，与物种形成的特殊机制有关（葛颂，1994b）。甘草属中一部分种间的I值较高，除了其特殊的物种形成机制以外，同时也表明这些种是“最近分化的”。因而用等位酶资料来对甘草属进行分类学处理，显然是不合适的。但是，用遗传一致度来探讨其分化，仍然十分有效。

从幼苗发育的结果上看，短荚果类型的G．pallidiflora与G．yunnanensis幼苗类型相似，这两个种的形态特征也很相似，但从等位酶分析却发现，两者存在着较大距离。从图1可发现，G．yunnanensis是本属中遗传差异最大的一个种，是本属中分化最早的一个种。但从染色体组型上分析，G．yunnanensis是本属中最进化的种（李学禹等， 1991）。因此，G．yunnanensis是本属中分化较早、进化较快的一个种，因其分化较早，因而在其幼苗类型上与G．pallidiflora相似，也表明这两种的幼苗类型是一种原始类型。在地理位置上，G．yunnanensis是本属在中国分布纬度最低的一个种，且与其他的种存在着完全的地理隔离，推测G．yunnanensis是以一条独特的演化路线进入云南的。

G．pallidiflora为本属在中国最为古老的一个种，分布于我国东北、华北。与其遗传关系最近的种为G．inflata与G．uralensis；G．inflata是长荚果系中荚果最短和膨胀的种，G．uralensis是分布最为广泛的种，可认为本属长荚果类型是从短荚果类型中演化而来。且G．uralensis、G．inflata从分布区上看，均为本属中最为靠近G．pallidiflora的分布区的种，因而可认为，在中国存在着从东向西这样一条甘草属的演化路线。

从Gst＝0．428来看，有42．8％的总变异存在于居群间，而57．2％的总变异存在于居群内，说明甘草属分化程度较为强烈。

张富民 李学禹 葛颂

国家自然科学基金项目：39270050

18Pacific Science congress，Population，Rescurces and Environment：

Collection of Abstracts，G3－PO－08P－34．

新疆第六届植物学学术年会《论文及论文摘要汇编》，1997，13－21