甘草属分类与胀果甘草等位酶分析

摘 要：本文运用等位基因酶技术，分析了胀果甘草复合体（Glycyrrhiza inflata complex）8种等位酶系统的10个等位基因位点，从基因水平上研究了本复合体中各居群的遗传结构与遗传多样性水平。研究表明，10个居群材料间的遗传一致度（Ⅰ）均大于0．85，说明胀果甘草、黄甘草以及阿拉尔甘草间具有很高的遗传相似性；F值与Gst值表明该类群的传粉方式以异交为主；同一地区的胀果甘草与阿拉尔甘草和黄甘草之间，或胀果甘草与阿拉尔甘草之间具有较高的遗传一致度，说明同域的不同甘草物种之间存在基因交流；黄甘草很可能是胀果甘草与乌拉尔甘草的天然杂交种。

关键词：胀果甘草；黄甘草；阿拉尔甘草；等位酶分析

胀果甘草（Glycyrrhiza inflata）曾因其成熟时果荚膨胀而得名，果荚直，果荚宽度／果荚厚度接近1∶1，羽状复叶具小叶3～5枚，叶缘明显皱褶。主要分布于我国新疆，集中分布于塔里木盆地周缘的河流沿岸以及吐鲁番与哈密盆地，甘肃西北部及疏勒河沿岸也有少量分布。黄甘草（G．eurycarpa）是1960年由张鹏云和彭泽祥首先命名的，其果实成熟时果荚稍胀、果弯，羽状复叶具小叶7～9枚，叶缘稍皱。分布于新疆与甘肃。阿拉尔甘草（G．alalensis）是李学禹（1993）命名的一个新分类群，仅分布于新疆，果荚稍胀，果荚直，羽状复叶具小叶7～11枚，叶缘平直不皱褶。3种甘草因形态上相似，故将其统称为胀果甘草复合体（complex）。植物表型上的差异可能是受环境饰变的影响，也可能是遗传分化的结果。由于同工酶技术提供了一大批可靠的遗传标记，因此为生物的遗传变异和进化的研究提供了一种重要的方法，也为系统发育关系的建立找到了一条新的途径（葛颂，1994b）。本文运用等位酶技术对胀果甘草复合体的不同居群材料进行了遗传多样性分析，旨在寻找胀果甘草、黄甘草与阿拉尔甘草形态相似与分异的遗传学证据，进而揭示三者可能的演化路线。

1．材料和方法

以居群为单位野外采样，采集本复合体10个居群及2个相关居群（AW及BHW）的成熟种子，在25℃的光照恒温培养箱中培养5天，每个居群选取发育良好的个体8～14株，取子叶作为试验材料，加Tris－马来酸复杂提取缓冲液在－20℃的冰块上充分研磨提取，得到样品液，加芯子，随即加样电泳或将浸好样的沁子置于－80℃的低温冰柜中保存备用。Tris－马来酸复杂提取缓冲液按Soltis等（1983）的配方进行配制，提取前加0．1％（V／V）的巯基乙醇作保护剂。

采用水平切片，淀粉凝胶电泳，凝胶模盘的规格为185mm×160mm×6mm及185mm×80mm×6mm，每板胶可加32～40个样品芯子。

在预试验的基础上选取分离及显带效果较好的＃1B及＃6电泳、凝胶缓冲液，配方如下：＃1B柠檬酸三钠／0．01mol／L组氨酸缓冲液（据Gottlieb，1981，略作改动）。

电泳缓冲液（0．4mol／L柠檬酸三钠）：117．64g柠檬酸三钠加水至1 000m L，用1mol／L HCl或柠檬酸调酸度至p H7．0。

＃6硼酸钠／Tris－柠檬酸，p H8．6缓冲液（据Mitton et al．，1979）。

电泳缓冲液：

0．1mol／L Na OH，0．3mo1／L硼酸。

4．00g氢氧化钠＋18．55g硼酸＋水至1 000m L，调酸度至p H8．6。

凝胶缓冲液：

0．015mol／L Tris 0．004mol／L柠檬酸。

1．84g Tris＋0．69g柠檬酸＋水至1 000m L，调酸度至p H7．8。

采用33m A稳流电泳及250V稳压电泳，凝胶通电后放在4℃的玻璃门冰箱中跑胶，以保证在电泳过程中酶的低温条件和便于观察。用溴酚蓝作为电泳前锋线标记，等前锋线跑出距起点12cm左右时，停止电泳，取下来进行切片和组织化学染色。

经预备试验，从12个酶系统中筛选出效果较好的8个酶系统（表1）。

表1 8种酶及其英文缩写

依照常规，等位酶位点和等位基因的命名，以酶的缩写字母代表该酶系统，连字符后数字代表该酶不同的位点（有多个位点时），越靠近正极的位点，迁移率越大，以越小的数字表示。每个位点的等位基因用小写英文字母代表，靠正极最近，即迁移率最大的等位基因以a代表，其次以b代表，依此类推。实验材料见表2。

表2 实 验 材 料

选用下列几个指标进行遗传变异的度量：①多态位点百分率（P）；②每个位点等位基因平均表（A）；③平均每个位点的等位基因的有效数目（Ae）；④平均每个位点的预期杂音度（He）；⑤平均每个位点的实际杂合度（Ho）；⑥内繁育系数及固定指数（F）；⑦基因分化系数（Gst）；⑧遗传一致度（I）；⑨遗传距离（D）；⑩居群每代迁移数（Nm）；多样性指数（PI）。

2 酶谱分析及等位基因的确定

通过预备试验，筛选出8种酶共13个等位酶位点，由于其中3个位点，即MDH－2， ADH－3及TPI－1的谱带尽管很清晰，分离良好，但因为部分居群的材料谱带的“丢失”，而不能参与统一分析，故本研究只选10个位点来讨论。

（1）天冬氨酸转氨酶（Aspartate aminotransferase）（AAT，E．C．2．6．1．1）

该酶又名谷氨酸草酰乙酸转氨酶，简称谷草转氨酶（Glulamate oxaloacetate transaminase，GOT），存在于植物细胞的细胞液、叶绿体、线粒体和微体中（Kephart， 1990），与氨基酸代谢有关。该酶是二聚体结构（Kephart，1990；王中仁，1994），在本复合体的研究中，只检测出一个活性区，仅有一对等位基因。

（2）氨肽酶（Aminopeptidase）（AMP，E．C．3．4．11．1）

该酶又名亮氨酸氨肽酶（Leucine aminopeptidase）（LAP）。该酶是个单体酶，一般有2～3个位点，存在于植物细胞的细胞液中，与蛋白质的分解有关（Kephart，1990）。在本复合体中，只检测出一个活性区。

（3）磷酸葡萄糖变位酶（Phosphoglucomutase）（PGM，E．C．5．4．2．2）

该酶是个单体酶，一般存在于植物细胞的细胞液及叶绿体中，与淀粉转化成糖有关。据文献中报道，该酶一般可有两个位点（Kephart，1990），但本复合体的研究中只检测出一个位点。

（4）苹果酸脱氢酶（Malate dehydrogenase）（MDH，E．C．1．1．1．37）

该酶是个二聚体酶，一般有3个位点，该酶一般存在于植物细胞的细胞液、线粒体及微体中，与三羧酸循环、光呼吸及C4植物的光合作用有关（Kephart，1990）。

由于部分谱带未显带，所以MDH－1与MDH－2不能进行统一分析，只选取单态位点MDH－3进行遗传分析。

（5）磷酸葡萄糖异构酶（Phosphoglucoisomerase）（PGI，E．C．5．3．1．9）

该酶是个二聚体结构，通常存在于植物细胞的细胞液及叶绿体中，常具两个位点。本研究中检测出两个活性区，其中第一个活性区迁移率最低，受单态位点控制，命名为PGI－1，而PGI－2则是个多态位点。(www.xing528.com)

（6）（乙）醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase）（ADH，E．C．1．1．1．1．）

该酶是个二聚体结构，通常存在于植物细胞的细胞液中，与发酵作用有关（Kephart， 1990），具1～3个位点。本研究中检测出3个活性区，其中第一个活性区迁移率最低，是个多态的位点，命名为ADH－1；第二个活性区也是个多态位点，但因部分谱带未能显出，故不能参与统一的遗传分析；第三个活性区是受单态位点控制，命名为ADH－3。

（7）还原型辅酶Ⅰ心肌黄酶（NADH－diaphorase）（DIA，E．C．1．6．2．2）

该酶又名黄递酶，据报道该酶有单体、二聚体及三聚体3种报道，一般存在于植物细胞的细胞液、叶绿体及线粒体中，与细胞内的氧化途径有关，具1～4个位点（Kephart， 1990）。本研究只取第二个活性区即DIA－2进行分析。

（8）磷酸丙糖异构酶（Triose phosphate isomerase）（TPI，E．C．5．3．1．1）

该酶存在于植物细胞的细胞液及叶绿体中，是二聚体结构，具两个位点，参与糖酵解与卡尔文循环等反应。本文检测出两个活性区，但因第一活性区缺少部分谱带，未能参与进一步的遗传分析，故只取第二活性区进行分析，并命名为TPI－2。

3 结果与讨论

3．1 居群的遗传变异（表3）

表3 12个居群在10个位点上的等位基因频率

表4 复合体10个居群及2个相关居群的遗传多样性指标及固定指数

由表4可见，所有居群在几个遗传多样性指标上都是很高的，多态位点百分率Y （0．05标准）变动在40％～70％之间；平均每个位点的等位基因数A在1．4～1．7的范围内变动；平均每个位点的等位基因的有效数目Ae则在1．339～1．595之间。F＝1－Ho／He常被用来反映居群中实际杂合体比率偏离理论期望比率的程度。F在－1～1之间变动，若F＞1说明居群中杂合体不足，若F＜1则说明居群中杂合体过量。

从表4可见，所有居群的F值均小于0，可见，在整个复合体的居群中都普遍存在着杂合体过量，说明在自然状态下，杂交（异花授粉）的普遍存在。居群BA的F值竟高达－0．875，而Shi H居群的F值最低，为－0．170，这表明Shi H居群主要以无性繁殖的方式来增加个体数，而BA居群中异花传粉的机制则最为健全。这与两个居群的数量特性及该居群的起源有关。阿拉尔甘草居群的各参数值（A平均）明显地高于其他居群，暗示该类群起源较晚，其遗传变异的丰富度较高。

在自然界中，阿拉尔甘草的分布区很局限，但总是与胀果甘草的分布区重叠，且果形上较相似，这说明阿拉尔甘草可能起源于胀果甘草。黄甘草的分布区亦较狭窄，常与胀果甘草及乌拉尔甘草混生，依Hamrick和Godt（1990）（表5）的观点，窄域种的遗传变异水平＜地区种＜广布种。但从表4不难看出，黄甘草的各项参数值（H平均）并不是很低，而且有几项的值如P值及Ho的值反而高于胀果甘草（Z平均）及乌拉尔甘草（W平均）的值，这暗示着黄甘草本身可能蕴藏着一种杂种优势。但由于对Shi H居群的不合理的采挖，使得居群的遗传多样性有所下降。黄甘草可能是胀果甘草与乌拉尔甘草的杂交种。乌拉尔甘草由于是个广布种，所以其F值很突出。

表5 不同类型植物的遗传变异水平和居群分化程度

（摘编自Hamrick ＆Godt，1990；葛颂，1994a）

多样性指数（PI）是描述居群内遗传多样性的一个指标。以酶谱谱带为性状，利用各谱带在居群样本中出现的相对频率计算前10个居群中的遗传多样性指数，见表6。

表6 复合体10个居群8种等位酶指标10个位点上的多样性指数（PI）

由表6可见，在不同居群中有不同程度的多样性，其中TA居群的多样性指数最高（1．49），而Shan Z居群的多样性指数最低（0．89）。分析PI值的大小，可得如下顺序：

PI（TA）＞PI（AA）＞PI（BA） 　 PI（Shi H）＞PI（YH）

PI（DZ）＞PI（Sha Z）＞PI（YZ）＞PI（AZ）＞PI（Shan Z）

PI值越高，说明居群内的遗传多样性越丰富，居群的进化层次就越高。这一点与该类群染色体组型分析的结果是一致的。

3．2 居群间的遗传分化

基因分化系数Gst是度量居群间遗传分化程度较理想的指标。Gst值在0～1间变动，当Gst＝0时，说明居群间几乎没有分化；而当Gst的值接近1，说明居群间有着很高的分化程度。计算该复合体全部10居群间的Gst值，并分别计算这10个居群在居群水平和种级水平上的遗传变异水平，结果见表7。

表7 复合体10个居群内遗传变异水平及居群间遗传分化状况

从表7可见，该复合体居群间的Gst＝0．178，即只有17．8％的变异是存在于居群间的，而82．2％的变异存在于居群内，说明各居群之间的基因流动频率很高，居群间的分化程度低。这与该复合体的异花传粉习性是相吻合的，也与该复合体在形态上的差异不大是相一致的。

不同居群间遗传组成上的差异有两个来源，环境因子的选择和基因流的隔离。我们认为，本复合体10个居群间遗传组成上的差异，特别是存在于个别位点少数等位基因上的显著差异的主要原因有二：一方面，这10个居群分布于新疆的北疆、南疆、中疆与东疆，无论在海拔、气候、土壤，还是在温度、水分方面都存在着较大的差异，植物对不同生态小环境的适应可以导致不同居群遗传结构上的显著差异（Gehring et al．，1992；Taylor et al．，1990）；另一方面的原因可能在于居群间的基因流。如前所述，本复合体是以异交为主的传粉方式，地理因素是造成这种基因流隔离的主要原因，如BA居群与DZ居群在空间上相隔了近1 500km，且之间有天山阻隔。

对12个居群进行遗传一致度（I）和遗传距离（D）的计算，结果见表8。对角线以上为遗传距离值（D），对角线以下为遗传一致度值（I），选取I值进行聚类分析（clustering analysis），结果见图1。

表8 12个居群间遗传相似性系数（遗传一致度I） （对角线下）及遗传距离D（对角线上）

图1 4种甘草12个居群材料的聚类分析图

从图1可以看出，阿克苏产阿拉尔甘草（AA）和吐鲁番产阿拉尔甘草（TA），两者关系密切，相似性系数很高，这与本复合体的数值分类学的研究结果是相一致的。焉耆产胀果甘草（YZ）、焉耆产黄甘草（YH）、16团产黄甘草（Shi H）和沙雅产胀果甘草（Sha Z）较早地聚合在了一起，有较高的相似性。从图中还可以发现，同域分布的居群间有较高的相似性，如阿克苏产胀果甘草（AZ）和阿克苏产阿拉尔甘草（AA）之间，焉耆产胀果甘草（YZ）和焉耆产黄甘草（YH）之间，以及16团产黄甘草（Shi H）和沙雅产胀果甘草（Sha Z）之间，相似性系数均高达0．95以上。这可能是由于地理生境的重叠为彼此间的基因交流提供了一个极大的可能，从而使得在等位酶研究结果上显示出较高的相似性。

鄯善产的胀果甘草居群（Shan Z）与其他居群的材料聚合得最晚，相似性系数最低，这是由于其与其他居群之间缺少基因交流的缘故。这与前面的多样性指数（PI）、He及Ae等参数的研究结果是相一致的，即彼此之间存在较强的基因流，则居群的PI值、He及Ae值都较高；反之，则低。

马淼 李学禹

国家自然科学基金项目：39270050