摘 要：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对甘草属（Glycyrrhiza L．）植物短荚果系3个种和念珠状荚果系6个种与其近缘属4个种的子叶和下胚轴进行了超氧化物歧化酶、细胞色素氧化酶和过氧化物同工酶的分析。结果显示，属间、种间具有酶谱差异，每个属有其特征酶谱带。根据同工酶酶谱性状：下胚轴36个同工酶谱性状和子叶38个同工酶谱性状，分别对13个种进行了聚类分析，结果表明，13个种可划分为2类：甘草属（Glycyrrhiza L．）植物的9个种很好地聚在一组，盐豆木（Halimodendron halodendron）也在此组，表明两属间关系较近；苦豆子（Sophora alopecuroides）、骆驼刺（Alhagi sparsifolia）和小花棘豆（Oxytropis glabra）在另一组，表明它们关系较近。
关键词：甘草属；近缘属；同工酶；聚类分析
根据李学禹（1987，1992，1993）对甘草属（Glycyrrhiza L．）分类系统的短荚果系（Ser．Brevileguminaris X．Y．Li）、念珠状荚果系（Ser．Monilileguminaris X．Y．Li）划分，对甘草属短荚果系3个种、念珠状荚果系6个种，以及其近缘属4个种进行同工酶研究，目的是对属间、系内不同物种间同一种同工酶、不同种同工酶及同一物种不同器官（子叶、下胚轴）酶谱谱带进行分析，并通过聚类分析了解属间、种间亲缘关系。
1 材料与方法
1．1 材料培养
种子用98％硫酸处理30min，用清水冲洗干净，将种子分置于有滤纸的培养皿中， 25℃相对湿度30％左右，培养4～5d，取其子叶和下胚轴（距离子叶长度1cm）备用。
1．2 酶液制备
称取子叶、下胚轴0．5g，在0～4℃冰浴中加1m L、p H 8．0Tris－HCL缓冲液研磨，然后8 000rpm离心10min，上清液加等量40％的蔗糖，4℃冰箱中备用。
1．3 电泳
电泳采用不连续的聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳法。分离胶c＝6％～10％，浓缩胶c＝2．4％～3．2％。在4℃冰箱中电泳4～5h。
1．4 染色
细胞色素氧化酶（COD）同工酶染色法参见胡能书等（1985）；超氧化物歧化酶（SOD）同工酶染色法参见罗广华等（1986）；过氧化物酶（POD）同工酶染色法参见薛应龙等（1986）。
2 结果分析
2．1 甘草属与其近缘属4个种植物子叶同工酶的分析
2．1．1 过氧化物酶（POD）
同工酶分布于3个区：慢区（a区）共有5带；中区（b区）有5带；快区（c区）共有4条带。系间差距主要反映在b区的酶谱上；属间差异十分明显（图1）。
短荚果系的特有带是P6，P2、P3、P7、P14五条带为系内3个种共有，刺毛甘草缺P8、P10、P11三条带，是系内带数最少的种；刺果甘草是系内酶带最多的种；云南甘草缺P10、P12带，系内种间酶谱差异十分明显。
念珠状荚果系中P2、P9、P8、P14为共有酶带，P5为大叶甘草特有，其余各种间差异表现在a区、b区酶带：P4、P3的缺失。系内种间差异较明显。但是，紫花甘草和平卧甘草的POD同工酶谱带完全相同（图1）。
其近缘属4个种P4为共有酶带，其余酶带差异十分明显，盐豆木的4条带与粗毛甘草、平卧甘草、紫花甘草P2、P3、P4、P14四条带完全相同，它们之间的关系较为密切。
图1 子叶的过氧化物酶同工酶酶谱
2．1．2 细胞色素氧化酶（COD）
同工酶分布于3个区：慢区（a区）共有5条带；中区（b区）有3条带；快区（c区）共有2条带。属间差异主要反映在c区的酶谱上（图2）。
C1为共有酶带，C9、C10为甘草属植物特有，C7为念珠状荚果系特有。短荚果系的种间差异十分明显，但念珠状荚果系中，垂花甘草、紫花甘草、平卧甘草酶谱完全相同；大叶甘草和疏花甘草酶谱也完全相同。种间差异不明显。
图2 子叶的细胞色素氧化酶同工酶酶谱
其近缘属4个种酶带差异十分明显。骆驼刺和小花棘豆的C1和C2带与大叶甘草和疏花甘草酶谱一样。
2．1．3 超氧化物歧化酶（SOD）
同工酶分布于3个区：慢区（a区）共有3条带；中区（b区）有7条带；快区（c区）共有4条带。种间差异明显（图3）。
S6、S8、S9、S10、S13、S14为甘草属植物共有；短荚果系中缺S2带，为念珠状荚果系特有；种间酶谱差异明显。
念珠状荚果系中，S11为平卧甘草特有，粗毛甘草、大叶甘草缺S1带，垂花甘草、紫花甘草缺S12，种间差异十分明显（图3）。
其近缘属4个种酶带差异十分明显，苦豆子的5条带和盐豆木的6条带甘草属植物都有，表明它们之间的关系较为密切。
图3 子叶的超氧化物歧化酶同工酶酶谱
2．2 甘草属植物与其近缘属4个种下胚轴同工酶的分析
2．2．1 过氧化物酶（POD）
同工酶分布于2个区：a区共有9条带，b区有4条带。属间差距反映在b区的酶谱上，种间差距反映在a区的酶谱上；属间系间差距明显，种间差异一般（图4）。
短荚果系甘草特有带是P11，而P12、P13带为刺果甘草特有，种间酶谱差异十分明显。
念珠状荚果系中，紫花甘草与垂花甘草酶谱完全相同；疏花甘草缺P10带，但P2为其特有带，具有P5、P4带；大叶甘草具P5带缺P10带；平卧甘草缺P7带。种间差异明显。由于P11为短荚果系特有，系间差异十分明显（图4）。
其近缘属4个种酶带差异十分明显。苦豆子的3条带和盐豆木的6条带甘草属植物都有，表明它们之间的关系较为密切。而小花棘豆和骆驼刺具有特殊的P1带。
图4 下胚轴的过氧化物酶同工酶酶谱
2．2．2 细胞色素氧化酶（COD）
同工酶分布于2个区：a区共有7条带，b区有2条带，b区带为甘草属植物共有，属间和系间、系内种间差异表现在a区酶带上，属间、系间差异十分明显（图5）。(www.xing528.com)
短荚果系中，刺果甘草缺C3、C2两带，云南甘草缺C4带，种间差异十分明显（图5）。
念珠状荚果系中，垂花甘草、紫花甘草、平卧甘草、大叶甘草、粗毛甘草酶谱完全相同，只有粗毛甘草C3和C7两条活性有异；疏花甘草缺C3带，但C2为其所特有。种间差异不明显（图5）。
图5 下胚轴的细胞色素氧化酶同工酶酶谱
其近缘属4个种酶带与甘草属植物差异十分明显。苦豆子、盐豆木、小花棘豆和骆驼刺具有特殊的P1带，表明它们之间的关系较为密切，并且属间差异明显。
2．2．3 超氧化物歧化酶（SOD）
同工酶分布于3个区：a区共有3条带，b区有8条带，c区共有3条带。S5、S9、S10、S14带为甘草属植物共有，系间差异、种间差异不明显（图6）。
短荚果系中，S1、S3为刺毛甘草所特有，云南甘草和刺果甘草具有完全相同的带；种间差异不明显（图6）。
念珠状荚果系中，紫花甘草和大叶甘草酶谱完全相同，垂花甘草和疏花甘草的酶谱完全相同；S13带为平卧甘草特有，S4、S7为粗毛甘草特有，S8带为紫花甘草、平卧甘草、大中甘草所特有；种间差异不明显（图6）。
其近缘属4个种酶带与甘草属植物差异十分明显。苦豆子、盐豆木、小花棘豆和骆驼刺具有明显的差异，酶谱带分布无规律性。
图6 下胚轴的超氧化物歧化酶同工酶酶谱
2．3 甘草属植物与其近缘的同工酶差异比较
2．3．1 甘草属植物与其近缘属相异性比较
从所分析的3种同工酶的分析结果来看，属间酶谱的差异十分明显，各系间基本上都有自己的酶带。此外，从图谱上还可看出，短荚果系POD、SOD和COD无论用子叶还是下胚轴分析，效果都十分好，念珠状荚果系中用POD分析效果较理想。甘草属植物的近缘属4个种间相异性无论用POD、SOD和COD同工酶分析效果都理想。总之，种间同工酶酶谱差异大，系间同工酶酶谱差异较大，属间同工酶酶谱差异很大。
2．3．2 属内种间相异性和相同性比较
短荚果系内3个种的同工酶酶谱差异十分显著，几乎所有的分析图中都具有特有带。如大叶甘草POD的P5带，云南甘草子叶COD的C6带，刺毛甘草下胚轴SOD的S1、S3两条带等。
念珠状荚果系内，种间相似性很大。如：COD（下胚轴）分析图中，几乎所有种的酶谱完全一致；SOD分析图中，紫花甘草和大叶甘草、疏花甘草和垂花甘草的酶谱完全相同等等。这可能是系内所有的种来源于同一个祖先。
甘草属植物近缘属4个种间相异性比较大，没有十分明显的规律，表明植物属间亲缘关系较远，差异性十分明显。
2．4 甘草属植物与其近缘属4个种同工酶酶谱类平均聚类分析
2．4．1 性状的选取与编码
选取甘草属植物短荚果系3个种和念珠状荚果系6个种与其近缘属4个种为分类运算单位（表1），以过氧化物酶、细胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶酶带为原始数据。
表1 用于同工酶分析的植物
性状编码：
子叶的性状共38个：POD同工酶14条带的有无，SOD同工酶14条带的有无，COD同工酶10条带的有无。下胚轴的性状共36个：POD同工酶13条带的有无，SOD同工酶14条带的有无，COD同工酶9条带的有无，共计74个性状。（注：一级带为4，二级带为2，三级带为1，无为0。）
2．4．2 数学方法简要说明
在聚类图上根据徐克学等人方法作结合线，全部数学运算用PC机进行聚类；采用UPGMA法（徐克学等，1982）。平均欧氏距离公式为：
2．4．3 甘草属与其近缘属同工酶酶谱的聚类分析
分别对以上所列74个性状的数据为原始数据进行聚类。得聚类图（徐克学等， 1983），L为结合线（图7）。所分析的13个种被结合线L分为两大类，类群Ⅰ包括李学禹划分的2个系：短荚果系［S（Ⅰ）：Brevileguminaris X．Y．Li］和念珠状荚果系［S（Ⅲ）：Monilileguminaris X．Y．Li］的9种甘草，即云南甘草（G．yunnanensis）、刺果甘草（G． pallidiflora）、刺毛甘草（G．echinata）、紫花甘草（G．purpureiflora）、垂花甘草（G． nutantiflora）、平卧甘草（G．prostrata）、粗毛甘草（G．aspera）、大叶甘草（G．macrophylla）、疏花甘草（G．laxiflora），另外，盐豆木（H．halodendron）也在此组，表明两属间关系较近。类群Ⅱ包括苦豆子（S．alopecuroides）、骆驼刺（A．sparsifolia）和小花棘豆（O． glabra），表明它们关系较近。
图7 聚类图（平均欧氏距离，UPGMA）
3．讨论
同工酶被广泛应用于植物学的各分支学科，成为有史以来研究自然居群遗传变异、亲缘关系以及进化的最有效的手段。但是在系统学的研究中我们应当注意，与形态特征和次生物质相比，酶固然是更为直接的基因产物，但它毕竟不是基因的直接产物，有一个表达调节和修饰的问题。一种酶的同工酶系统往往受到一个基因位点的复等位基因或多个位点的等位基因的控制，因而同工酶往往具有许多条酶带，仅根据其中的一条酶带的有无来研究酶谱的异同有一定的局限性。因而，在我们的研究中有几点体会：
（1）尽可能取不同部位的材料做同一分析用。取样时，必须有统一的标准，严格操作，把人为误差减少到最低限度。
（2）所分析的同工酶种类应尽量多，从而减少只有一种同工酶分析的局限性。
（3）只用某条酶带的有或无、显带的程度作为确定物种亲缘关系的指标或相异性的依据仍不够充分。如果在酶谱分析中采取相似性指标进行排序、欧氏距离、相关系数、遗传一致度等定量分析的方法，可或多或少弥补以上缺陷。
（4）采用酶谱聚类分析方法，可较形象地显示各物种间、居群间的相关性，这对探讨种间亲缘关系、居群间的遗传关系有其显著的优越性。对甘草属植物各物种间亲缘关系，甘草属植物与其近缘属间亲缘关系的研究我们进行了初步探索。
崔卫东做了部分分析工作，在此表示感谢。
张煜星 李学禹 张富民
发表于《石河子大学学报》（自然科学版），1999，3（4）：308－314
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