甘草属实验生物学研究揭示分类系统

摘 要：对甘草属的长荚果系，采取聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分析它们的主脉同工酶。结果表明：每个种具有明显的酶谱差异，有其特征酶带；从酶谱的相似度指数来看，6、6a、8、8a的相似度高，亲缘关系较近。而2、4、5、8b的相似度指数较低，它们之间的亲缘关系较远。经过薄层色谱扫描，根据每个酶谱的峰面积的百分率，采用系统聚类法——最短距离法进行聚类分析，以欧式距离4．0为分类线，将甘草属长荚果系分为两类：Ⅰ类为1、5、6、6a、7、8、8b；Ⅱ类为2a、4、8a。

关键词：甘草属；酯酶同工酶；亲缘关系

1 材料与方法

1．1 材料及其形态特征

试验材料8种及4变种，共计12个样品，均来源于新疆。样品形态特征如下：

（1）Glycyrrhiza shiheziensis：羽状复叶，小叶7～19枚；花序长于叶或近相等，小花长介于光果甘草与乌拉尔甘草之间；小叶基部心形或微心形；荚果单向弯曲，具长喙。

（2）G．eurycarpa：羽状复叶，小叶5～7枚，叶缘波状；荚果宽，稍膨胀，向腹缝线弯曲。2a产阿瓦提16团上游水库，其小叶5～7枚；荚果不如前者宽，且稍弯曲。

（3）G．alalensis：羽状复叶，小叶7～11枚；花序长于叶，旗瓣边缘波状；荚果稍胀，呈柱状，光、直。

（4）G．inflata：羽状复叶，小叶3～7枚，叶缘波状；花序长于叶；荚果明显膨胀，宽厚比值为1。

（5）G．korshinskyi：羽状复叶，小叶7～13枚，叶缘稍波状，先端锐尖或渐尖；花序、果序近等于叶；荚果单向半月形弯曲，荚果壳腺体毛稀疏或无。

（6）G．uralensis：羽状复叶，小叶7～17枚，先端钝尖或圆；花序、果序紧密呈球状，并绝对短于叶；荚果“之”形折叠多向弯曲，并密被腺毛。6a产石河子，花序与果序不为球状，甚疏散，长总状及柱状，稍短于叶。

（7）G．eglandulosa：羽状复叶，小叶11～15枚；总状花序等于或稍长于叶；小花子房无腺体，翼瓣耳明显内弯；荚果“S”形多向弯曲，无腺体毛。

（8）G．glabra：羽状复叶，小叶7～21枚；花序长于叶；荚果细长、光、直。8a产于玛纳斯，子房密被腺体；荚果密被具柄腺体毛，直，较原变种稍宽。8b产于巴楚，子房光滑，荚果镰状或半月形弯曲。

1．2 方法

对甘草属（Glycyrrhiza L．）长荚果系（Ser．Longileguminaris X．Y．Li）的12个类群（表1）进行发芽培养，先用浓硫酸浸泡种子0．5h，然后用清水冲洗干净，把这些种子分别置于有滤纸的培养皿中，加入水，于25℃的生长箱中，萌发10天后，取用这些材料的子叶，用聚丙烯酰胺凝胶垂直平极电泳法测定酯酶（EST）同工酶，然后用岛津CS－930型双波长薄层色谱扫描仪对酯酶同工酶进行扫描，波长为425nm。

表1 研究材料及其产地

酶液制备与电泳：称取子叶0．5g，加入1m L p H8．0Tris－HCl缓冲液于研钵内，在冰浴中研成匀浆，然后以2m L提取液分几次洗，离心管高速离心机以4 000×g离心10min，取上清液，以等量40％蔗糖溶液混合，留作点样，凝胶的点样量为25μL，分离胶浓度为7．2％，浓缩胶浓度3．2％，在4℃冰箱中电泳4h，酯酶同工酶的染色用磷酸缓冲液系统坚牢蓝PR盐染色法。

2 结果与分析

2．1 甘草属长荚果系不同种的酯酶（EST）同工酶谱

由图1的酯酶同工酶的特点和迁移率（Rf值）的不同，将酶谱由正极向负极分成a，b，c三区的酶带分别标为a1—a10、b1—b10、c1—c7。从图中可见，甘草属长荚果系的不同种在3个区都有酶带分布，不同种的带位和带数是不同的，颜色较深的一级酶带主要分布在慢带区（c区），在3个区内都有颜色较浅的弱带。但是不同种的甘草在酶谱上又有各自的特征带。表2中可见，2号G．eurycarpa，2a号G．eurycarpa都含有a7带，说明这两者亲缘关系较为密切；6号G．uralensis，6a号G．uralensis也具有a7带，说明这两者的关系也较为密切；8a号G．glabra var．glandulosa，8b号G．glabra与8号G．glabra含有c1、c3或c1带，说明这三者的亲缘关系近；5号G．korshinskyi与6号G．uralensis都具有c5、c6带，这两者亲缘关系也较近；而3号G．alalensis具有b6特征带。(www.xing528.com)

图1 甘草属长荚果系不同种的酯酶同工酶谱

表2 甘草属长荚果系不同种的酯酶同工酶带的比较

续 表

2．2 酶谱相似度指数与亲缘关系

酯酶同工酶是基因的产物，也是分子水平的表现型。因此，从酯酶的表现型的差异可以反映出基因型的差异，从基因型差异程度可以看出种间或种群间亲缘关系的远近。Vaughan等提出酶谱相似度指数以预测种间的亲缘关系，相似度指数愈高，则亲缘关系较近。由Vaughan公式估算结果列于表3。由表中可见，8号G．glabra与8b号G． glabra的相似度指数较高，均为0．16，说明这两者的亲缘关系较近；7号G．eglandulosa与3号G．alalensis的相似度指数也较高，在0．09以上，说明这两种甘草的亲缘关系也较密切；而2号G．eurycarpa，2a号G．eurycarpa，8号G．glabra var．glandulosa等的相似度指数都较低，说明它们之间的亲缘关系较为疏远。原因可能是进化过程中发生了变异所造成的。

表3 甘草属长荚果系不同种的酯酶同工酶的相似度指数

＊相似度指数＝相同酶带数／（相同酶带数＋不同酶带数）。

2．3 甘草属长荚果系不同种的酯酶同工酶的聚类分析

将供试材料的酯酶同工酶的电泳凝胶，用岛津CS－930型双波长薄层色谱扫描仪对酶谱进行扫描，波长为425nm（图2）。根据各酶谱峰面积的百分率，采用系统聚类法——最短距离法进行聚类分析，其遗传距离列于表4、表5。如以欧氏距离4．0为分类线，可把甘草属长荚果系分为两类（图3）。

图2 长荚果系不同种的酯酶同工酶的薄层扫描图

表4 不同种甘草间的欧氏距离

表5 甘草属的各类间的欧氏距离

图3 甘草属长荚果系不同种的酯酶同工酶的聚类图

Ⅰ类：包括1号G．shihcziensis，5号G．korshinskyi，6号G．uralensis，6a号G． uralensis，7号G．eglandulosa，8号G．glabra，8b号G．glabra。这类甘草的遗传距离较短，而以1号G．shiheziensis与5号G．korshinskyi之间的遗传距离最短，为2．674 17，其亲缘关系最为密切。石河子甘草（1号G．shiheziensis）分布在新疆玛纳斯河中下游，其形态性状的某些参数（如叶序小叶，小花长，萼筒长，旗瓣长，荚果）往往是在光果甘草（8号G．glabra）和乌拉尔甘草（6号G．uralensis）之间。因此，它们之间的亲缘关系密切。膜荚甘草（5号G．korshinskyi）主要分布于原苏联伏尔加河左岸、西西伯利亚、高加索从咸海至里海岸，我国仅产于新疆孔雀河沿岸的库尔勒、塔什店、塔里木河中游的巴楚。根据形态描述，费希尔认为膜荚甘草是光果甘草与乌拉尔甘草的杂交种。无腺毛甘草（7号G．eglandulosa）是乌拉尔甘草的近缘种，说明这类甘草的亲缘关系较为密切。

Ⅱ类：包括有2a号G．eurycarpa，4号G．inflata，8a号G．glabravar．glandulosa，3号G．alalensis，2号G．eurycarpa。这类甘草与石河子甘草（1号G．shiheziensis）的种间遗传距离较大。李沛琼、张鹏云、彭泽祥教授认为黄甘草（2号G．eurycarpa）是胀果甘草（4号G．inflata）与乌拉尔甘草（6号G．uralensis）的杂交种。

潘鼎元 张煜星 李学禹

国家自然科学基金项目：39270050

发表于《植物研究》，1995，15（4）：477－484