甘草属分类系统与实验生物学研究

摘 要：应用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳对甘草属（Glycyrrhiza L．）的7个种及2个变种［乌拉尔甘草、无腺毛甘草（变种）、光果甘草、蜜腺甘草（变种）、胀果甘草、膜荚甘草、黄甘草、粗毛甘草和刺果甘草］叶片中的过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶进行了分析。结果表明，本属植物的每个种都有其特征酶谱，而各种间的酶谱具有明显差异，2个变种和原种间的差异也十分明显。这从分子水平上证实了前人对甘草属种间的分类是正确的。

关键词：同工酶；过氧化物酶；酯酶；甘草；聚丙烯酰胺凝胶电泳

生物体的遗传性状都是由基因决定的，不同的等位基因所表达的蛋白质及相对的遗传性状均不同，从而产生了生物间种与种或原种与变种之间的差别。同工酶是由单基因座复等位基因或多基因座复等位基因编码的蛋白质，人们把它看作是基因和性状的联结物，而把同工酶分析法作为研究基因－酶－性状的新技术。该方法广泛应用于生理病理、系统发育、杂交育种、植物分类和亲缘关系等方面的研究。

甘草属系豆科植物，约有21种，是我国重要的中药资源之一，目前仍以野生资源为主，主要分布于西北、华北和东北等地区，尤以新疆、内蒙古、宁夏、甘肃等地为主要产区。为了更好地开发利用甘草药物资源，必须使甘草属种的分类更符合于自然关系。甘草属植物的形态分类研究历史悠久，而对能表达遗传信息的同工酶研究还未见有报道。本文对产于新疆的7个种及2个变种的甘草进行了过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶酶谱的分析研究。

1 材料和方法

1．1 材料

（1）乌拉尔甘草，（1a）无腺毛甘草；（2）光果甘草，（2a）蜜腺甘草；（3）胀果甘草；（4）膜荚甘草；（5）黄甘草；（6）粗毛甘草；（7）刺果甘草。

以上样品温室水培取叶片，经处理后提取酶液，经聚丙烯酰胺垂直平板凝胶电泳后，分离出谱带、同工酶染色，拍照。

甘草属7个种和2个变种的甘草种子由新疆石河子农学院提供。样品编号、植物名称和学名见表1。

表1 供试样品的编号、名称及学名

1．2 方法

（1）酶液提取

上述样品种子经适当处理后，均在温室中用水培养萌发成幼苗。取叶片，用无离子水洗净后擦干，称重，剪碎后置预冷的研钵中，每克叶片加入1．5～2．0m L抽提液（0．05mol／L Tris－HCL，p H8．8），在冰浴中匀浆后，6 000rpm离心10min，上清液中加入固体蔗糖至终浓度达20％，放置冰箱备用。

（2）同工酶电泳(www.xing528.com)

采用聚丙烯酰胺垂直平板电泳。凝胶制备和缓冲系统的配方基本按文献（莽克强等， 1975）的方法。浓缩胶浓度为3．1％，分离胶浓度为7．5％，电极缓冲液为p H8．3的Tris－甘氨酸。每孔上样100μL，电流为20m A。电泳至溴酚蓝距凝胶下沿1cm处停止。

（3）同工酶染色

电泳结束后，取出胶板，按文献（蒋成山等，1983；Tanksley ＆Orton，1983）的方法进行过氧化物酶和酯酶特异性底物染色，然后用水漂洗至背景清晰，拍照并按电泳图谱描出模式图，最后制成干胶保存。

2 结果和讨论

甘草属的7个种和2个变种的过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，均能分离出较清晰的谱带（图1、图2）。

（1）根据谱带从阴极到阳极的迁移顺序，发现这两种同工酶谱带都有两个活性区：PX－Ⅰ，PX－Ⅱ和ET－Ⅰ，ET－Ⅱ。在过氧化物酶同工酶的两个活性区PX－Ⅰ和PX－Ⅱ以及酯酶同工酶的ET－Ⅰ活性区内都有1～2条甘草属共有的谱带，因此，经典分类法把它们归在同一个属内是无可非议的。

图1 甘草属不同种的过氧化物酶同工酶谱带模式图

图2 甘草属不同种的酯酶同工酶谱带模式图

（2）每个种的这两个同工酶在谱带的数目和谱带强弱上都有各自的特征性，这表明不同种的同工酶编码基因是有差别的。有的种之间酶谱较相似，而有的差别甚大，特别是7号刺果甘草的过氧化物酶同工酶与其他种的该酶酶谱差别较大，而7号酯酶同工酶和6号粗毛甘草的该酶在ET－Ⅰ活性区较相似，这可能是种间亲缘关系的远近所致。这两种同工酶的分析数据为甘草属种间系统演化研究提供了生化指标。1a无腺毛甘草和它的原变种1号甘草以及2a蜜腺甘草和它的原变种2号光果甘草间的两种同工酶谱都存在着明显差异。1号过氧化物酶同工酶共有8条谱带，而1a仅有2条，1号酯酶同工酶有9条谱带，而1a仅有3条。2号过氧化物酶同工酶有2条谱带，而2a有5条；2号酯酶同工酶有6条谱带，但2a仅有2条，且谱带的强弱也不相同。这些结果表明，编码不同种甘草同工酶的基因有较大差别。因此，从这两种同工酶的分析中，似乎有超出了变种界限的可能，还有待于进一步的研究。

朱俭 蔡武城 俞伟 吴斌 李学禹

国家自然科学基金项目：3870031

发表于《复旦大学学报》，1990，29（2）：225－229