酵母双杂合系统GAL4体系的实验材料与方法

酵母双杂合系统已有多种体系，在此以GAL4体系为例，介绍该系统所需要的实验材料和实验方法。

（一）酵母宿主菌株和酵母表达载体

1.酵母宿主菌株

（1）Y187报告宿主株，用于检测两已知蛋白间的相互作用。

（2）Y190报告宿主株，用于筛选同靶蛋白相互作用的融合文库蛋白。

（3）CG-1945报告宿主株，用于筛选同靶蛋白相互作用的融合文库蛋白。

2.酵母表达载体

不同的双杂合系统有不同的酵母表达载体。在GLA4表达系统中，除用于构建诱饵融合蛋白及文库融合蛋白的载体pAS2-1和pACT2外，还包含有其他对照质粒载体（附图2～附图7）。

（1）pAS2-18.4kb，DNA-BD载体，用于产生GAL4 DNA/BD和靶蛋白的融合蛋白。

（2）pACT28.1kb，AD载体，用于产生GAL4 AD与一种已知蛋白的融合蛋白。

（3）pVA3-19.4kb，阳性对照质粒，编码pAS2-1中DNA-BD/鼠p53杂合蛋白。

（4）pTD1-110.1kb，阳性对照质粒，编码pACT2中AD/SV40大T抗原杂合蛋白。

（5）pCL115.3kb，阳性对照质粒，编码并表达全长野生型GAL4蛋白。

（6）pLAM5′-1 9.1kb，假阳性检测质粒，编码pAS2-1中DNA-BD/人核纤层蛋白C杂合蛋白。

3.酵母菌的保存与表型鉴定

（1）实验材料、试剂

①YPD培养基 20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖，18g/L琼脂（固体），pH 5.8。

②SD培养基（极限培养基）6.7g/L无氨基酸的酵母氮源，20g/L琼脂（仅铺板用），850mL H₂O，100mL 10×缺省培养液，调pH至5.8，高压灭菌，待培养基冷却至55℃以下时，加3-氨基-1，2，4-三唑（3-AT）或放线菌酮。

③10×缺省培养液 10×缺省培养液包括除一种或多种下列成分的所有成分。例如，在准备SD/-Trp/-Leu培养基时，应使用缺乏Trp和Leu的10×缺省培养液。培养液高温灭菌后，4℃可保存一年。

10×缺省培养液配方 300mg/L L-异亮氨酸，1500mg/L L-缬氨酸，200mg/L L-腺嘌呤亚硫酸盐，200mg/L L-盐酸精氨酸，1000mg/L L-亮氨酸，300mg/L L-盐酸赖氨酸，200mg/L L-甲硫氨酸，500mg/L L-苯丙氨酸，2000mg/L L-苏氨酸，200mg/L L-色氨酸，300mg/L L-酪氨酸，200mg/L L-尿嘧啶，200mg/L L-盐酸单羟组氨酸。

④其他贮存液

a.1mol/L 3-AT（3-氨基-1，2，4-三唑）过滤除菌。

b.1mg/mL Cyh^R（放线菌酮）过滤除菌，4℃可保存2个月。

c.40%葡萄糖 高压灭菌或过滤除菌。

（2）酵母菌株的保存

①用灭菌的接种环从琼脂平板上挑取单菌落，将其置于200～500μL YPD液体培养基（或适宜的SD缺省培养基）中彻底悬浮，加50%灭菌甘油使终浓度达到25%，于-70℃储存。酵母株贮存在含25%甘油的YPD培养液中，-70℃可长期保存。

②酵母菌株的复苏用接种环或消毒牙签从冷冻贮存液中蘸取少许酵母菌，划线于YPD或适宜的SD琼脂平板上（已转化的酵母菌株最好保存在适宜的SD缺省培养基上，使质粒保持选择压力）。若菌株在冷冻前已沉管底，则在冰上融化冷冻培养物并振荡后取少许划线。琼脂平板划线面朝下，30℃孵育平板，直至菌落直径达2mm（约需3～5天）。若是转化株，在SD培养基上由于选择压力，生长较YPD缓慢，需4～6d。用保鲜膜密封平板，4℃可保存2个月。

（3）酵母菌株的表型鉴定 开始转化前，应对酵母菌株的表型进行鉴定。

①制备相应的SD平板。

②用接种环或消毒牙签从冷冻贮存液中蘸取少许菌液，划线于适宜的SD琼脂平板上。

③30℃孵育平板，约需4～6天，使表型出现。

④将结果与表14-1对照，保存表型正常的酵母菌株以备后用。

表14-1 酵母宿主菌株在各种培养基上的生长

①在5mmol/L 3-AT存在时；②在25mmol/L 3-AT存在时；③在1.0μg/mL放线菌酮存在时；④在10.0μg/mL放线菌酮存在时。

（二）诱饵DNA-BD/P-X表达载体的构建及鉴定

1.表达载体的纯化

将已知蛋白X的编码基因，按DNA-BD的阅读框架重组到pAS2-1中，转化感受态大肠杆菌，从大肠杆菌中纯化DNA-BD/P-X表达载体。

2.将纯化的DNA-BD/P-X表达载体转染酵母菌Y190

（1）实验材料、试剂

①SD/-Trp培养基 用Difco琼脂制备。

②10×TE缓冲液 0.1mol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，pH 7.5，无菌。

③10×LiAc（乙酸锂）贮液 1mol/L乙酸锂，pH 7.5（用稀乙酸调pH，过滤除菌）。

④1mol/L DTT（二硫苏糖醇）过滤除菌，-20℃贮存。

⑤50%（质量体积分数）PEG4000或PEG3350过滤除菌。

⑥PEG/LiAc（10mL）8mL 50% PEG4000，1mL 10×TE，1mL 10×LiAc。

⑦其他：1mol/L山梨醇，100% DMSO。

（2）仪器 恒温摇床，水浴锅，电穿孔仪等。

（3）操作方法

①电转化

a.实验前两天，将用于转化的酵母株单菌落接种于5mL YPD培养基中，30℃过夜培养至饱和。

b.实验前一天晚上，在装有500mL YPD培养基的2L无菌烧瓶中接种适量的过夜培养液，30℃剧烈摇动培养过夜，直至细胞密度达1×10⁸细胞/mL（OD₆₀₀为1.3～1.5，依菌株不同而异）。

c.4℃4000×g离心收集细胞，用80mL无菌水重悬。

d.加入10mL 10×TE缓冲液（pH 7.5）充分混匀，再加入10mL 10×乙酸锂贮液，摇匀，于30℃轻摇45min。

e.加入2.5mL 1mol/L DTT并同时旋转摇动，于30℃轻摇15min。

f.将酵母悬液稀释在500mL水中，以1500r/min 4℃离心，依次重悬细胞，所用溶液如下：第一次沉淀，250mL冰冷的水；第二次沉淀，20～30mL冰冷的 1mol/L山梨醇；第三次沉淀，0.5mL冰冷的1mol/L山梨醇。

每次重悬时充分吹打沉淀，使细胞完全散开，最后重悬细胞的体积在1.0～1.5mL之间，OD₆₀₀约为2.00。

g.往一个无菌、冰冷的 1.5mL微量离心管中加入50μL上述酵母细胞和不大于100ng的待转化DNA（体积不大于5μL），混匀。

h.将酵母与DNA混合物移至预冷的0.2cm间隙的转化杯中。

i.以2.5kV作脉冲转化。

j.电转化杯中加入350μL 1mol/L山梨醇回收并吹打均匀。

k.将酵母转化物涂于相应的SD/-Try培养板上，于30℃培养3～6天，直到平板上出现菌落。

②小剂量氯化锂转化方法

a.接种几个直径2～3mm新鲜克隆于1mL YPD培养基中。

b.剧烈振荡分散团块。

c.转入有YPD的锥形瓶中，30℃250r/min振荡孵育16～18h至OD₆₀₀＞1.5。

d.转移足量过夜培养物于YPD培养液中，使OD₆₀₀=0.2～0.3。

e.30℃230r/min振荡孵育3h，OD₆₀₀至0.4～0.6。

f.室温（20～21℃）1500r/min离心5min。

g.弃上清，加25～50mL无菌TE或水，混匀，悬浮细胞。

h.室温1500r/min离心5min，弃上清。

i.重悬细胞于新鲜配制的灭菌1×TE/LiAc 1.5mL中，制备成感受态细胞。

j.每管中加入DNA-BD载体表达质粒0.1μg、AD载体表达质粒0.1μg、蛙精DNA0.1mg，每管中加入上述感受态细胞100μL，并充分混匀。

k.加入0.6mL PEG/LiAc涡悬10s充分混匀细胞。

l.30℃200r/min振荡孵育30min。

m.加入约70 μL DMSO至10%终浓度，轻轻倒转混匀。

n.42℃水浴热休克15min，在冰上冰冷细胞1～2min。

o.离心沉淀细胞，14000r/min离心5s，弃上清。

p.0.5mL 1×TE缓冲液重悬细胞。

q.取100μL细胞悬液，涂于相应SD培养板上，30℃培养直至克隆长出（一般2～4天）。

3.对转染了DNA-BD/P-X载体的Y190进行鉴定

在双杂合实验前，需对转染了DNA-BD/P-X载体的Y190进行鉴定。首先，应确定在Y190中DNA-BD/P-X载体确实能表达该融合蛋白；其次，要检测表达的DNA-BD/P-X自身是否有转录激活活性；最后，还要观察表达的DNA-BD/P-X对酵母宿主菌本身是否有毒害作用及程度。

（1）实验材料与试剂

①Z缓冲液

调pH至7.4，高压灭菌，室温可保存1年。

②X-gal贮存液 20mg/mL X-gal，用二甲基甲酰胺溶解，-20℃避光保存。

③Z缓冲液/X-gal液 100mL Z缓冲液，0.27mLβ-ME（β-巯基乙醇），1.67mL X-gal贮存液，ONPG（邻硝基酚-β半乳糖苷）4mg/mL，用Z缓冲液配制，pH 7.0。

④1mol/L Na₂CO₃。

⑤Whatman #5或VWR级410滤纸（灭菌）75mm滤纸（如VWR#28321-055）用于100mm平板；125mm滤纸（如VWR#28321-113）用于150mm平板。

⑥液氮。

（2）操作方法

①Western杂交检测DNA-BD/P-X在Y190中的表达 选取在选择培养基上生长的酵母克隆进行扩大培养，然后提取酵母蛋白或利用酵母菌体总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，而后转膜，利用抗DNA-BD抗体或抗P-X抗体作一抗，确定DNA-BD/P-X在Y190中有特异表达。

②检测表达的DNA-BD/P-X是否有转录激活活性在筛库前要排除DNA-BD/P-X自身具有转录激活活性，假如有，需要对P-X编码基因进行改造，使其转录激活活性失活，否则无法进行酵母双杂合筛选。通常用以下两种方法进行检测。

a.β-半乳糖苷酶活性滤膜分析

（a）为得到更好的实验效果，酵母最好是在孵箱中生长2～4d，直径在1～3mm。

（b）配制Z-缓冲液/X-gal液，在每一个100mm或150mm平板内用Whatman#5或VWR级410滤纸，所需配制液2.5～3mL。

（c）将一张干净、消毒滤纸放在生长有菌落的琼脂平板表面，轻轻按压滤纸，使菌落部分粘附在滤纸上，手法要轻，勿使整个菌落完全粘于滤纸上，以免影响以后挑选克隆菌株。

（d）在平板和滤纸上，穿3个不对称的小孔，以示方位标记。

（e）小心用镊子取出滤纸，接触菌落面朝上，放入液氮中完全浸泡10s。

（f）接触菌落面朝上，小心将滤膜放在上述经Z缓冲液/X-gal浸泡的滤膜上，注意不要在滤膜之间或下面留有气泡。30℃（室温）放置，记录菌落显蓝色的时间。(www.xing528.com)

注：产生β-半乳糖苷酶的菌落变蓝的时间长短不一，显色时间在30min至8h，超过8h，可能为假阳性。

（g）将滤膜（纸）按预先做的定位标记完全重叠，从而鉴定平板上产生β-半乳糖苷酶的阳性克隆。从平板上挑选阳性克隆至适宜新鲜液体的SD培养基（如Y190在SD/-Trp）中。将平板继续培养1～2d并保存。

b.以ONPG为底物液体培养分析

用ONPG为底物通过液体培养，定量分析β-半乳糖苷酶活性的活性。

（a）前述转化菌长出后，取完整的（直径1～3mm）酵母菌培养在5mL液体培养基中。

（b）30℃振荡培养（230～250r/min）过夜。

（c）取ONPG溶解在Z缓冲液（终浓度4mg/mL）振荡1～2h。

（d）取上述过夜培养菌液2mL转移至8mL YPD培养基中，30℃振荡培养（230～250r/min）3～5h，至OD₆₀₀在0.5～0.8（对数生长期）。

（e）剧烈振荡菌液0.5～1min，分散菌块，精确记录OD₆₀₀值。

（f）分别取 1.5mL至 1.5mL离心管中，14000r/min离心 30s。小心弃上清，用1.5mL Z缓冲液沉淀。

（g）悬浮沉淀在300μL Z缓冲液中（浓缩5倍）。

（h）取100μL悬浮液至新的离心管中，并放入液氮中冻0.5～1.0min，取出37℃水浴融化0.5～1.0min。

（i）以100μL Z缓冲液为空白管，分别加入0.7mL Z缓冲液/β-巯基乙醇至反应管和空白管中。

（j）记录时间，立即加0.16mL ONPG/Z缓冲液至反应管和空白管，30℃保温。

（k）出现黄色后，加0.4mL 1mol/L Na₂CO₃至反应管和空白管，终止反应，记录反应时间。

（l）反应管14000r/min离心10min，沉淀细胞碎片。

（m）小心转移上清至洁净样品池中，以空白管调零，测样品OD₄₂₀。OD₄₂₀值应该在0.02～1.0之间（此区间呈线性关系）。

（n）计算β-半乳糖苷酶活性单位 1个β-半乳糖苷酶活性单位定义为每分钟分解1μmoL ONPG生成硝基苯酚的酶活力。计算公式如下：

β-半乳糖苷酶活性单位=1000×OD₄₂₀/（T×V×OD₆₀₀）

式中 T——反应时间，min

V——0.1mL×浓缩系数

OD₆₀₀——A600/mL菌液

以ONPG为底物液体培养分析的结果差异很大，阳性对照在几分钟内即可变黄，而阴性对照在24h后仍不变色，所以在该实验中要及时观察颜色变化，尤其在开始的几个小时内，以免使颜色过深而影响实验结果。

③观察表达的DNA-BD/P-X对酵母宿主菌本身是否有毒害作用及程度 观察转染了DNA-BD/P-X表达载体的Y190的生长情况，若DNA-BD/P-X对Y190的生长无影响，则可考虑在后面筛库时采用分步转染法，以提高效率；若其对Y190的生长有影响，但影响较小，则可考虑在后面筛库时采用共转染法；若其对Y190的生长影响很大，甚至不能使其生长，后继工作也将无法进行。

（三）与AD融合表达的cDNA表达文库的构建

在pACT2中构建一个与GAL4 AD融合表达的cDNA表达文库，使其至少含有10⁶种不同杂合蛋白，或根据需要购买不同种属和不同组织的cDNA文库。当得到一小部分AD表达文库后，根据其滴度，将其扩增，以便获得足够的质粒DNA用于酵母转化。

（四）与P-X互作蛋白的筛选

在确定DNA-BD/P-X在Y190中有特异表达，自身无转录激活活性，且对Y190的生长并无影响后，采用分步转化法进行文库筛选。

（1）以转染有DNA-BD/P-X表达载体的Y190作感受态。

（2）以电转化或氯化锂转染法（操作方法同前），将GAL4 AD融合表达的cDNA表达文库质粒转染感受态细胞，涂布于SD/-Try-Leu-His+3 AT平板。于30℃培养4～6天，直到平板上出现菌落。这时注意设立阴阳对照，以检测系统是否正常工作。转染文库质粒的量，由预实验的转染效率决定，总之要保证至少转进去一个以上的文库。

（3）4～6d后，对平板上出现的菌落进行β-半乳糖苷酶活性分析（方法同前）。

（4）保存获得的阳性克隆。

（五）阳性质粒的分离

由于在阳性克隆中同时存在DNA-BD/P-X表达载体和与P-X相互作用的AD/P-Y融合表达的表达载体，因此要通过放线菌酮去除克隆中的DNA-BD/P-X载体，以便获得能与P-X相互作用的AD/P-Y质粒。

1.实验试剂、材料

（1）SD/-Leu+Cyh^R培养基。

（2）β-半乳糖苷酶活性滤膜分析所用试剂（同前）。

2.操作方法

①从每个重划线培养的平板上，且经酶活性滤膜分析鉴定的Lac Z⁺、His⁺阳性克隆中，选一个直径为1～3mm的克隆，重悬于200μL无菌水中，于涡悬振荡器上彻底分散细胞。

②100μL细胞悬液铺在SD/-Leu+Cyh^R培养板上，30℃孵育，直至出现独立的Cyh^R克隆，历时3～5d。

③通过将Cyh^R克隆转移至SD/-Trp/-Leu培养板上，进一步确认pAS2-1或其衍生物的丢失，丢失了这种质粒的克隆因色氨酸缺陷不能再生长。

④同时再用β-半乳糖苷酶活性滤膜分析，进一步确认SD/-Trp/-Leu培养板上的Cyh^R克隆是否还有LacZ⁺报告基因的表达。若有则为假阳性结果，无转录活性的才为阳性克隆。

（六）酵母交配对筛得的阳性克隆进一步验证

酵母交配是一种较容易地将两种不同质粒导入同一个宿主细胞的方法。该方法可用于验证通过双杂合文库筛选所获的候选AD/文库，后者仅在出现DNA-BD/靶蛋白时激活报告基因。在交配实验中，可用Y190或CG-1945作为候选AD/文库质粒的宿主菌。

1.准备工作

（1）分别用下列5种质粒转化Y187酵母细胞，并在SD/-Trp平板上筛选Trp ⁺转化株：PAS2-1（DNA-BD载体）质粒，PAS2-1/靶质粒，DNA-BD/对照质粒（该杂合质粒能融合表达DNA-BD及任何无关或突变蛋白）。

（2）单独用AD载体转化CG-1945或Y190酵母细胞，在SD/-Leu平板上筛选Leu⁺转化株。

（3）对每一种AD/文库候选质粒，应该用步骤（1）、（2）中筛选获得的Trp ⁺和Leu⁺转化株按表14-2进行酵母交配分析。

表14-2 酵母交配表型分析

2.酵母交配

（1）挑取各类单克隆（2～3mm直径）进行交配。

（2）将两个克隆放在含0.5mL YPD的 1.5mL EP管中剧烈振荡，30℃振荡培养（250r/min）6～18h。

（3）涂布上述交配培养液在100mm SD/-Leu/-Trp9（CG-1945菌株）及SD/-Leu/-Trp/-His+3-AT（Y190菌株）平板上。若交配株培养小于8h，则涂布100μL菌液；若大于8h，则涂布10μL菌液。

（4）将平板置30℃培养3～5天，直至生长出二倍体细胞。计算生长在SD/-Leu/-Trp/-His+3-AT上的菌落。

3.确认二倍体细胞的Lac Z和His表型

为了重新证实蛋白-蛋白之间的相互作用，利用菌落影印滤膜分析方法检测上述新鲜His⁺菌落的β-半乳糖苷酶活性，弃除β-半乳糖苷酶活性呈阳性的克隆而只含AD/文库质粒的菌株。

（七）酵母质粒的提取、分类及测序

在获得只含有AD/P-Y载体的阳性克隆后，就可以将其提取出来用于测序，从而知道是哪种分子与P-X相互作用。然而，从酵母中提取的质粒纯度较差，不能直接用于测序，还需将其转化到细菌中进行纯化后，再行测序。另外，从文库中筛得的阳性克隆很多，对每一个克隆进行纯化、测序，费时、费力，可通过PCR的方法对它们进行分类后，再行测序。

1.酵母质粒的提取

（1）实验材料、试剂

①悬浮缓冲液 10mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1mmol/L EDTA，4.5U/μL溶壁酶，过滤除菌，4℃贮存。

②酵母裂解液 2%Triton X-100，1% SDS，100mmol/L Tris（pH 8.0），1.0mmol/L EDTA。

③苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）用中性酚（pH 7.0）配制。

④酸洗玻璃珠 425～600μm。

⑤95%～100%乙醇。

⑥10mol/L乙酸胺。

⑦LB培养基。

⑧LB琼脂+Amp ⁺平板。

⑨SD/-Leu+Cyh^R培养基。

（2）操作方法

①将已分离好的独立Cyh^R克隆菌落接种入3mL SD/-Leu+Cyh^R培养基中。

②于30℃250r/min振荡至少20h，直至培养物饱和。

③1.5mL培养物至离心管中，14000r/min室温离心1min，去上清。

④加入30μL悬浮缓冲液，并吹打充分混匀，37℃孵育30min。

⑤加入170μL裂解缓冲液至离心管中，并加入200μL玻璃珠。

⑥每管再加入200μL酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）。

⑦充分涡旋振荡5min，14000r/min离心10min。

⑧转移上清至新的离心管中，加入8μL 10mol/L乙酸铵。

⑨加入500μL 95%～100%乙醇，-70℃放置 1h。

⑩14000r/min离心10min，去上清，真空干燥。

⑪沉淀重悬于2μL H₂O中。

2.通过PCR分析阳性克隆

（1）实验试剂、材料

①PCR反应混合物 5′和3′PCR反应引物，Taq DNA聚合酶，10×反应缓冲液，dNTP混合物，PCR级去离子H₂O，酵母质粒DNA。

②DNA分子量标准。

③6×上样缓冲液 4℃保存。

④1×TBE缓冲液 89mmol/L Tris-硼酸，2mmol/L EDTA（pH 8.0）。

⑤琼脂糖。

⑥溴化乙锭（EB）10mg/mL，避光保存，4℃。

（2）操作步骤

①配制每一个克隆PCR反应混合物。

②将各个反应物放入PCR仪样品池中，进行PCR扩增。

③回收PCR产物，用识别4个碱基的内切酶对其进行酶切。

④配制适宜浓度的琼脂糖凝胶（用1×TBE缓冲液配制）。用微波炉加热，使琼脂糖熔解，温度降至60℃时加入EB（终浓度达0.5μg/mL）混匀，灌制胶块。

⑤取酶切产物，加入上样缓冲液混匀。

⑥上样并进行电泳，电压选择为1～5V/cm。

⑦电泳后，在紫外线仪或凝胶成像仪下根据DNA分子量标准确定各个AD克隆插入片段酶切后的带形。以此进行归类，每一类选一个克隆准备转化细菌。

3.取酵母质粒转化细菌即可测序