实验试剂：EMSA检测试剂盒及底物平衡缓冲液的使用方法

1.原核生物中进行外源蛋白诱导，外源蛋白提取、纯化和浓缩所用试剂

（1）LB液体培养基（低盐）蛋白胨 10g，酵母粉5g，NaCl 5g，用蒸馏水溶解后，调pH至7.3，定容至1000mL，室温保存。

（2）1mol/L IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）IPTG 2.383g，用蒸馏水溶解后，定容到10mL，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于1.5mL离心管中，-20℃冻存。

（3）1×PBS（pH 7.4）NaCl 8.2g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄0.24g，用蒸馏水溶解后，定容到1000mL，室温保存。

（4）缓冲液I NaH₂PO₄·2H₂O 1.48g，Na₂HPO₄·12H₂O 14.5g，NaCl 29.3g，用蒸馏水溶解后，调pH至7.4，定容至1000mL，室温保存。

（5）缓冲液II NaH₂PO₄·2H₂O 0.74g，Na₂HPO₄·12H₂O 7.25g，NaCl 14.7g，咪唑17g，用蒸馏水溶解后，调pH至7.4，定容至500mL，室温保存。

（6）Triton X-100室温保存。

（7）缓冲液2咪唑浓度20mmol/L，96mL缓冲液I加4mL缓冲液II，充分混匀，室温保存。

（8）缓冲液3咪唑浓度50mmol/L，90mL缓冲液I加10mL缓冲液II，充分混匀，室温保存。

（9）缓冲液4咪唑浓度100mmol/L，80mL缓冲液I加20mL缓冲液II，充分混匀，室温保存。

（10）缓冲液5咪唑浓度200mmol/L，60mL缓冲液I加40mL缓冲液II，充分混匀，室温保存。

（11）缓冲液6咪唑浓度300mmol/L，40mL缓冲液I加60mL缓冲液II，充分混匀，室温保存。

（12）缓冲液7咪唑浓度400mmol/L，20mL缓冲液I加80mL缓冲液II，充分混匀，室温保存。

（13）4mol/L NaCl NaCl 23.4g，用蒸馏水溶解后，定容至100mL，室温保存。

（14）超滤缓冲液母液1——0.2mol/L Gly（甘氨酸）：1.54g Gly，用蒸馏水溶解后，定容至100mL，4℃保存；母液2——0.2mol/L NaOH：取0.8g NaOH，用蒸馏水溶解后，定容至100mL，4℃保存。取50mL母液1加6mL母液2，调pH至8.8，用蒸馏水定容至200mL，4℃保存。

（15）5μg/μL溶菌酶 从 100μg/μL的储存液取50μL，用MilliQ水定容到 1mL，4℃保存。

2.SDS-PAGE蛋白检测所用试剂（适用于分子质量在10ku以上的蛋白分子）

（1）30%丙烯酰胺（质量体积分数）Acr（丙烯酰胺）29.2g，Bis（亚甲基双丙烯酰胺）0.8g，用蒸馏水溶解后，定容至100mL，过滤，4℃保存。

（2）10% SDS（十二烷基磺酸钠）10g SDS用蒸馏水溶解后，定容至100mL，过滤，室温备用。

（3）1.5mol/L Tris-HCl（pH 8.8）Tris（三羟甲基氨基甲烷）18.2g，用蒸馏水溶解后，调pH值至8.8，定容至100mL，4℃保存。

（4）1mol/L Tris-HCl（pH 6.8）Tris 121.1g，用蒸馏水溶解后，调pH至6.8，定容至100mL，4℃保存。

（5）10% AP（过硫酸铵）AP 0.1g，用蒸馏水溶解后，定容至1mL，4℃保存，但时间不宜超过一周。

（6）TEMED（四甲基乙二胺）Bio-Rad公司（美国）产品，4℃保存。

（7）1mol/L DTT（二硫苏糖醇）DTT 0.154g，用蒸馏水溶解后，定容至 1mL，-20℃冻存。(www.xing528.com)

（8）2×SDS-PAGE上样缓冲液 1mol/L Tris-HCl（pH 6.8）5mL，1mol/L DTT 0.1mL，SDS 2g，溴酚蓝0.1g，甘油 10mL，用蒸馏水溶解后，定容至50mL，分装于1.5mL离心管中，4℃保存，使用时按等体积加入。

（9）1×SDS-PAGE电极缓冲液（pH 8.3）Tris 3.0g，Gly 14.4g，SDS 1g，用蒸馏水溶解后，定容至1000mL，室温保存。

（10）脱色液 无水乙醇100mL，HAc（乙酸）100mL，用蒸馏水溶解后，定容至1000mL，室温保存。

（11）考马斯亮蓝R-250染色液 考马斯亮蓝R2505g在500mL脱色液中溶解，过滤，用棕色瓶在室温保存。

3.EMSA检测所用试剂

（1）5×TBE Tris 54g，硼酸 27.5g，EDTA 2.93g，用蒸馏水溶解后，调pH至8.0，定容至1000mL，室温保存。

（2）0.5×TBE取5×TBE 100mL，用蒸馏水稀释至1000mL，室温保存。

（3）Gly-NaOH缓冲液 即超滤Buffer。

（4）1mol/L KCl-20℃冻存。

（5）0.1mol/L DTT取1mol/L DTT 0.1mL，用蒸馏水稀释至1mL，-20℃冻存。

（6）0.1% BSA（牛血清白蛋白）-20℃冻存。

（7）5μg/μL BSA取BSA 5mg，用蒸馏水溶解后，定容至1mL，分装在1.5mL离心管中，-20℃冻存。

（8）5×上样缓冲液EMSA检测试剂盒提供，4℃保存。

（9）封闭液EMSA检测试剂盒提供，4℃保存。

（10）4×洗涤液EMSA检测试剂盒提供，4℃保存，使用时用MilliQ水4倍体积稀释。

（11）底物平衡缓冲液EMSA检测试剂盒提供，4℃保存。

（12）稳定过氧化氢溶液EMSA检测试剂盒提供，4℃保存。

（13）鲁米诺/增强溶液EMSA检测试剂盒提供，4℃保存。

（14）显影液 使用上海冠龙照相器材公司的D76显影粉，将小袋内药粉溶解于约50℃的750mL蒸馏水中，搅动至完全溶解之后，再将大袋内药粉倒入，继续搅动使之完全溶解，加水定容至1000mL，避光，于棕色瓶中室温保存。

（15）定影液 使用上海冠龙照相器材公司的酸性定影粉，准备20℃左右的800mL蒸馏水，将药粉缓缓倒入，搅拌使之完全溶解，加水定容至1000mL，避光，于棕色瓶中室温保存。

4.部分需购买试剂

pET-32a（+）载体（Novagen），溶菌酶（BBI），Ni-NTA Sefinose^TM6快流速凝胶柱（BBI），咪唑（BBI），超滤管（Millipore），生物素标记探针合成（SBS），Light-Shift化学发光EMSA试剂盒（Pierce）。