RFLP技术在分子微生物学实验中的应用与操作步骤

1.实验材料

基因组DNA（大于50kb，分别来自不同的材料）。

2.实验设备

电泳仪及电泳槽，照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板（比胶块略大）4块，吸水纸若干，尼龙膜（依胶大小而定），滤纸，EP管（0.5mL）若干。

3.实验试剂

（1）限制性内切酶（BamHⅠ，EcoRⅠ，HindⅢ，XbaⅠ）及10×酶切缓冲液。

（2）5×TBE电泳缓冲液（1L）54g Tris，27.5g硼酸，2.93g EDTA，用蒸馏水溶解后，调pH至8.0，定容至1000mL，室温保存。

（3）变性液 0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl。

（4）中和液 1mol/L Tris-HCl，pH 7.5，1.5mol/L NaCl。

（5）10×SSC（1L）87.7g NaCl，44.1g柠檬酸钠，NaOH调节pH至7.0。

（6）其他试剂 0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris-HCl，2×SSC（pH 7.5），ddH₂O，琼脂糖0.8%，0.25mol/L HCl。

4.操作步骤

（1）基因组DNA的酶解

①大片段DNA的提取详见基因组DNA提取实验，要求提取的DNA分子质量大于50kb，没有降解。

②在50μL反应体系中加入：

③轻微振荡，离心，37℃反应过夜。(www.xing528.com)

④取5μL反应液，0.8%琼脂糖电泳观察酶切是否彻底，这时不应有大于30kb的明显亮带出现。

（2）Southern转移及杂交

①酶解的DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳（可18V过夜）后EB染色观察。

②将凝胶块浸没于0.25mol/L HCl中脱嘌呤10min。

③取出胶块，蒸馏水漂洗，转至变性液变性45min。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30min。

④预先将尼龙膜、滤纸浸入水中，再浸入10×SSC中，将一玻璃板架于盆中，铺一层滤纸（桥），然后将胶块反转放置，盖上尼龙膜，上覆两层滤纸，再加盖吸水纸，压上半公斤重物，以10×SSC盐溶液吸印，维持18～24h。也可用电转移或真空转移。

⑤取下尼龙膜，0.4mol/L NaOH溶液处理30s，迅速转至0.2mol/L Tris-HCl、pH7.5的2×SSC溶液中，5min。

⑥将膜夹于两层滤纸内，80℃真空干燥2h。

⑦探针的制备和杂交详见第十一章分子杂交部分。

5.注意事项

①基因组DNA酶解时，未酶切的DNA要防止发生降解，酶切反应一定要彻底。

②Southern转移及杂交时步骤②中脱嘌呤时间不能过长。步骤②、③、⑥、⑦均在摇床上进行操作。

③Southern转移及杂交时步骤④中，当尼龙膜覆于胶上时，绝对防止胶与膜之间有气泡发生，加盖滤时也不应有气泡发生。

④有时用一种限制性内切酶不能发现RFLP的差异，这时应该试用另一种酶。