不同的反应条件对杂交结果的影响如下。
（1）根据杂交液的体积确定杂交的时间一般来说使用较小体积的杂交液比较好，因为在小体积溶液中，核酸重新配对的速度快、探针用量少，从而使滤膜上的DNA在反应中起主要作用。但在杂交中必须保证有足够的杂交溶液覆盖杂交膜。
（2）根据所用的杂交溶液确定杂交的温度 一般来说，杂交相为水溶液时，则在68℃杂交；而在50%甲酰胺溶液中时，则在42℃下杂交。
（3）选用不同的封闭试剂 如Denhardt′s试剂、肝素，或一种由5%脱脂奶粉组成的BLOTTO，这些试剂中需加入断裂的鲑鱼精子DNA或酵母DNA，并和SDS一起使用。与Denhardt's试剂相比，BLOTTO价格便宜，使用方便，同样可获得满意的结果，但它不能用于RNA杂交。一般而言，尼龙膜用Denhardt's试剂比用BLOTTO能得到更高的信噪比。对硝酸纤维素滤膜而言，通常在预杂交溶液和杂交溶液中都含有封闭剂；但是对尼龙膜，经常从杂交溶液中省去封闭剂，因为高浓度的蛋白质会干扰探针和目的基因的退火。
（4）根据需要在杂交过程中选用不同的振荡方法和程度 许多杂交膜一起反应时，连续的轻微振荡可获得较好的杂交结果。
（5）在杂交过程中加入其他化合物 如反应体系中加入 10%硫酸葡聚糖或 10%PE G，杂交速度可增加约10倍。检测稀有序列时常用该方法，但它们有时会导致本底较高，并由于溶液的黏稠性而使操作困难。因此，除非在滤膜上含有的目的DNA量很少，或放射性探针的量有限，一般不用硫酸葡聚糖或PE G。
（6）根据探针与被检测目标之间的同源程度选择清洗的程度 如具有很高的同源性，可选用严紧型洗脱方式（高浓度SSC），反之则选用非严紧型洗脱方式（低浓度SSC）。洗脱通常在低于杂交体解链温度12～20℃的条件下进行。解链温度（Tm）是指在双链DNA或RNA分子变性形成分开的单链时光吸收值增加的中点处温度。通常富含G+C碱基对序列比富含A+T碱基对序列的Tm温度高。
（7）根据标记探针的浓度及其比活性选择不同的杂交条件及检测方法一般使用新的同位素可获得较强的信号。在水溶液中杂交时，用6×SSC或6×SSPE溶液的效果都一样；但在甲酰胺溶液中杂交时，应该用具有更强缓冲能力的6×SSPE。(www.xing528.com)
上述这些条件的改变，对杂交的结果有不同的影响，应根据研究的具体情况，选用适当的方法。
思考题
1.核酸探针的标记方法有哪些？
2.要获得好的杂交结果，需注意哪些因素？
3.如果放射自显影后，X光片背景很黑，请分析原因及写出预防措施。
4.Western杂交中转膜过程的作用是什么？
5.Western杂交结果不理想的原因都有哪些？如何避免？
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