菌落原位杂交实验步骤及结果

对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100～200）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。

1.实验材料

待检测的细菌平皿，已标记好的探针，硝酸纤维素滤膜等。

2.实验设备

恒温烤箱，恒温水浴，台式高速离心机等。

3.实验试剂

（1）LB固体培养基。

（2）0.5mol/L NaOH。

（3）1mol/L Tris-HCl（pH 7.4）。

（4）1.5mol/L NaCl。

（5）0.5mol/L Tris-HCl（pH 7.4）。

（6）预洗液 5×SSC，0.5%SDS，1mmol/L EDTA（pH 8.0）。

（7）预杂交液 50%甲酰胺，6×SSC（或6×SSPE），0.05×BLOTTO（甲酰胺可不用）。

（8）其余试剂 与Southern杂交相同。

4.操作步骤

（1）将少数菌落转移到硝酸纤维素滤膜上

①在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张硝酸纤维素滤膜。

②用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上，再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂主平板上。应按一定的格子进行划线接种（或打点）。每菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。

③倒置平板，于37℃培养至划线的细菌菌落生长到0.5～1.0mm的宽度。

④用已装防水黑色绘图墨水的注射器针头穿透滤膜直至琼脂，在3个以上的不对称位置作标记。在主平板大致相同的位置上也作上标记。(www.xing528.com)

⑤用Parafilm膜封好主平板，倒置贮放于4℃，直至获得杂交反应的结果。

⑥裂解细菌，按本段下面所述方法，使释放的DNA结合于硝酸纤维素滤膜上。

（2）菌落的裂解及DNA结合于硝酸纤维素滤膜

①在一张保鲜膜上制作一个装有0.5mol/L NaOH的小洼（0.75mL），使菌落面朝上，将滤膜放到小洼上，展平保鲜膜，使滤膜均匀湿润，让滤膜留于原处2～3min。

②用干纸巾从滤膜的下方吸干滤膜，用一张新的保鲜膜和新配制的0.5mol/L NaOH重复步骤①。

③吸干滤膜，将滤膜转移到新的带有1mol/L Tris-HCl（pH 7.4）的保鲜膜洼上。5min后吸干滤膜，再重复一次该步骤。

④吸干滤膜，把它转移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris-HCl（pH 7.4）的保鲜膜小洼上，5min后吸干滤膜，转移到一张干的滤纸上，置于室温20～30min，使滤膜干燥。

⑤将滤膜夹在两张干的滤纸之间，在真空烤箱中于80℃干烤2h，固定DNA。

（3）杂交

①盛有2×SSC的塑料盘，将干烤的滤膜飘浮在液面上，彻底浸湿5min。

②将滤膜转到200mL预洗液的玻璃皿中。滤膜合叠在一起，放于溶液中。用保鲜膜盖住玻璃皿，放到位于培养箱内的旋转平台上，于50℃处理30min。在这一步及以后的所有步骤中，应缓缓摇动滤膜，防止它们粘在一起。

③用泡过预洗液的吸水棉纸轻轻地从膜表面拭去细菌碎片，以降低杂交背景而不影响阳性杂交信号的强度和清晰度。

④将滤膜转到盛有150mL预杂交液的玻璃中，在适宜温度（即在水溶液中杂交时用68℃，而在50%甲酰胺中杂交时用42℃）下，预杂交1～2h。

⑤将³²P标记的双链DNA探针于100℃加热5min，迅速置于冰浴中。单链探针不必变性。将探针加到杂交袋中杂交过夜。杂交期间，盛滤膜的容器应盖严，以防液体蒸发。

⑥杂交结束后，去除杂交液，立即于室温把滤膜放入大体积（300～500mL）的2×SSC和0.1% SDS溶液中，轻轻振摇5min，并将滤膜至少翻转一次。重复洗一次，同时应避免膜干涸。

⑦68℃用300～500mL 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜两次，每次1～1.5h。此时可进行放射自显影。如背景很高或实验要求严格的洗膜条件，可用300～500mL 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃将滤膜浸泡60min。

⑧把滤膜放在纸巾上于室温晾干后，把滤膜（编号面朝上）放在一张保鲜膜上，并在保鲜膜上做几个不对称的标记，以使滤膜与放射性自显影片位置对应。

⑨用第二张保鲜膜盖住滤膜。加X光片并加上增感屏于-70℃曝光12～16h。

⑩底片显影后，在底片上贴一张透明硬纸片。在纸上标记阳性杂交信号的位置，同时在不对称分布点的位置上做出标记。可从底片上取下透明纸，通过对比纸上的点与琼脂上的点来鉴定阳性菌落。