1.实验试剂
（1）SDS-PAGE试剂 参见第九章。
（2）Western杂交用封闭剂 5%脱脂奶粉（用TBST配制）。
（3）1×TBS缓冲液Tris-HCl缓冲液（0.5mol/L，pH 7.6）50mL，NaCl 4.5g，加去离子水至500mL。
（4）1×TBST缓冲液 1×TBS缓冲液加0.1%的Tween-20。
（5）湿转缓冲液 48mmol/L Tris（2.375g），39mmol/L甘氨酸（11.25g），20%甲醇200mL，0.0375% SDS，加水至1000mL。
（6）His抗体HRP标记的二抗。
（7）DAB底物显色缓冲液100mmol/L NaCl，5mmol/L MgCl2，100mmol/L Tris-HCl（pH9.5）。
（8）其他 电转液，丽春红。
2.实验仪器与材料
电转槽，电转夹，吸量管，摇床等。
3.实验方法
（1）SDS-PAGE电泳完成后，用适量的电转液平衡胶大约15min。
（2）根据胶的大小，剪一张同样大小的硝酸纤维素膜或PVDF膜，PVDF膜要用适量的甲醇浸泡3～5min后，转至电转液中平衡膜大约15min。
（3）用适量电转液湿润海绵垫和比胶略小的滤纸6张。
（4）按照以下顺序组装电转夹：电转夹阳极面、海绵垫、滤纸、膜、胶、滤纸、海绵垫、电转夹阴极面，用吸量管在滤纸表面慢慢滚动，以排出胶和膜之间的气泡。
（5）将电转夹放入已加入大约800mL电转液的电转槽中，在冷却的条件下100V电转60min。
（6）拆卸电转夹，可用丽春红染膜以观察转移效率（如果是预染分子量标准可直接观察），并标记膜的蛋白面。(www.xing528.com)
（7）用5%脱脂牛奶封闭膜，放在水平摇床上振摇，室温60min，用封闭液稀释一抗，工作浓度大约在1μg/mL，放在水平摇床上振摇，室温至少1h或4℃ 过夜。
（8）回收一抗，TBST洗膜，每次大约100mL，3～5min。
（9）按照操作说明用封闭液稀释HRP标记的二抗。初次使用建议按照 1∶3000稀释，以后可根据实验情况调整稀释比例。膜在二抗中于室温摇床1h。
（10）TBST洗膜3次，每次大约100mL，于摇床洗3～5min；TBS洗膜3次，每次大约100mL，于摇床洗3～5min，洗去残留的Tween-20。
（11）将膜置于底物溶液（比如：33μL BCIP/66μL NBT与10mL显色缓冲液混匀）中，显色观察并分析。
4.技术要点
（1）电转移注意事项
①切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。
②膜的预处理 膜漂在水面（或者甲醇液面）让液体从下通过膜上的孔渗上来以赶走膜内空气；膜彻底浸润后颜色会变深一点，任何白点或者斑都是没有完全浸润的标志，会影响转膜；最后浸没入缓冲液里平衡。
③关于电转“三明治”的组装 整个操作在转移液中进行，要不断地擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。
④确定胶的方向 如果目标蛋白小，指示剂的位置可以指示方向，但是如果蛋白大，指示剂已经跑出去了，就要留意分清胶的上下方向，切个小角是常用的方法。另外，预染的分子量标准可用以识别胶的上下方向和膜的正反面。但即使用了预染分子量标准，转移完成后还需要用针或者笔在膜上扎眼记录条带位置，以免被洗掉而无法判断结果。
⑤关于转膜时的温度 转膜时的温度比较重要，最好保持在10℃以下，Bio-Rad湿转仪可以在转膜液中放入合适的事先准备的冰袋（-70℃，多于3h），这样既可以降温又可以节约缓冲液。
（2）免疫反应注意事项
①一抗、二抗的稀释度，作用时间和温度等，对不同的蛋白要经过预实验来确定其最佳条件。
②有条件的用BSA作封闭剂，但好的脱脂奶粉封闭的效果也不错。可以使用雀巢高钙奶粉、多力精低脂奶粉、国产的三元奶粉。
③如显色采用敏感性比较高的发光检测法，加抗体（包括一抗和二抗）以后的漂洗中，可以用TBST漂洗。
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