Northern杂交与Southern杂交很相似。主要区别是被检测对象为RNA，其电泳在变性条件下进行，以去除RNA中的二级结构，保证RNA完全按分子大小分离。变性电泳主要有3种：乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上，然后与探针杂交。
1.实验材料
待检测的RNA及制备好的探针。
2.实验设备
电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，X光片，杂交袋，硝酸纤维素膜或尼龙膜。
3.实验试剂
（1）20×SSPE 175.3g NaCl，88.2g柠檬酸钠，溶于800mL水中，用10mol/L NaOH调pH至7.4，定容到1L。
（2）其他试剂与Southern杂交试剂类似，只是所有的试剂均需用DEPC处理。
4.操作步骤
（1）RNA经变性电泳完毕后，可立即将乙醛酰RNA转移至硝酸纤维素滤膜上。转移方法与转移DNA的方法相似。
（2）转移完毕后，以6×SSC溶液于室温浸泡此膜5min，以除去琼脂糖碎片。
（3）将该杂交膜夹于两张滤纸中间，用真空烤箱于80℃干燥0.5～2h。(www.xing528.com)
（4）用下列两种溶液之一进行预杂交，时间为 1～2h。若于42℃进行，应采用：50%甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt′s试剂，0.1% SDS；若于68℃进行，应采用：6×SSC，2×Denhardt's试剂，0.1%SDS。注意：BLOTTO不能用于Northern杂交。
（5）在预杂交液中加入变性的放射性标记探针，如欲检测低丰度mRNA，所用探针的量至少为0.1μg，其放射性比活度应大于2×108cpm/μg，放在适宜的温度条件下杂交16～24h。
（6）用1×SSC、0.1% SDS于室温洗膜20min，随后用0.2×SSC、0.1% SDS于68℃洗膜3次，每次20min。
（7）用X光片（Kodak XAR-2或与之相当的产品）进行放射自显影，附加增感屏于-70℃曝光24～48h。
5.注意事项
（1）如果琼脂糖浓度高于 1%，或凝胶厚度大于0.5cm，或待分析的RNA大于2.5kb，需用0.05mol/L NaOH浸泡凝胶20min，部分水解RNA并提高转移效率。浸泡后用经DEPC处理的水淋洗凝胶，并用20×SSC浸泡凝胶45min。然后再转移到滤膜上。
（2）在步骤（3）的操作中，如果滤膜上含有乙醛酰RNA，杂交前需用20mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）于65℃洗膜，以除去RNA上的乙二醛分子。
（3）RNA自凝胶转移至尼龙膜所用方法，与RNA转移至硝酸纤维素滤膜所用方法类似。
（4）含甲醛的凝胶在RNA转移前需用经DEPC处理的水淋洗数次，以除去甲醛。当使用尼龙膜杂交时注意，有些带正电荷的尼龙膜在碱性溶液中具有固着核酸的能力，需用7.5mmol/L NaOH溶液洗脱琼脂糖中的乙醛酰RNA，同时可部分水解RNA，并提高较长RNA分子（＞2.3kb）转移的速度和效率。此外，碱可以除去mRNA分子的乙二醛加合物，免去固定后洗脱的步骤。乙醛酰RNA在碱性条件下转移至带正电荷尼龙膜的操作也按DNA转移的方法进行，但转移缓冲液为7.5mmol/L NaOH，转移结束后（4.5～6.0h），尼龙膜需用2×SSC、0.1% SDS淋洗片刻，于室温晾干。
（5）尼龙膜的不足之处是背景较高，用RNA探针时尤为严重。将滤膜长时间置于高浓度的碱性溶液中，会导致杂交背景明显升高。可通过提高预杂交和杂交步骤中阻断试剂的量来予以解决。
（6）如用中性缓冲液进行RNA转移，转移结束后，将晾干的尼龙膜夹在两张滤纸中间，80℃干烤0.5～2h，或者254nm波长的紫外线照射尼龙膜带RNA的一面。后一种方法较为繁琐，但却优先使用，因为某些批号的带正电荷的尼龙膜经此处理后，杂交信号可以增强。然而为获得最佳效果，务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的氨基形成交联结构，而过度照射却使RNA上一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面，导致杂交信号减弱。
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