大肠杆菌超级感受态细胞制备实验

1.操作步骤

（1）用枪头或接种环挑取单克隆菌落，接种于5mL LB液体培养基中，37℃ 180r/min培养过夜（14～16h）。

（2）取2mL过夜培养的菌液，接入到100mL SOB液体培养基中，25℃ 180r/min振荡培养至OD₆₀₀为0.4～0.8。

（3）将菌液在冰上预冷30min。同时预冷离心机至4℃。

（4）随后将菌液分装到50mL预冷的离心管中，4℃2000r/min离心10min。

（5）弃上清，加入20mL转化缓冲液（TB）（表7-1），在冰中滑动，使沉淀重悬。

（6）4℃2000r/min离心10min。

（7）弃上清，加入20mL转化缓冲液（TB），在冰中滑动，使沉淀重悬。

（8）用8.37mL TB溶解沉淀。

（9）取630μL DMSO逐滴加入重悬的菌液中，边滴加边在冰中晃动离心管。

（10）取40个1.5mL离心管，插到泡沫上，把泡沫置于液氮上，然后将感受态细胞加入离心管中，每管150μL。(www.xing528.com)

（11）液氮冻实，转入超低温冰箱中冻存（-70℃保存10个月）。

表7-1 转化缓冲液（TB）溶液成分

2.注意事项

（1）所用器具需洁净。

（2）培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧生长还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值：培养基体积/三角瓶容量=100mL/500mL或50mL/250mL。

（3）培养基的pH。这里讲的pH并非单指配制或灭菌后的pH，还包括整个摇瓶结束后的pH。一般来说，接种前的pH在6.8～7.2；等菌摇好后，pH不要低于6.0，最好在6.5以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好。

（4）培养后的OD值是一个非常重要的参数，当OD值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6、0.8等。同时，OD值大时菌体总量大，感受态绝对数量要大一点。因此需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点。

（5）在保存感受态时，DMSO比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。

（6）液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。