CaCl2法制备感受态细胞及转化

1.实验材料

E.coliDH5α菌株：R^-，M^-，Amp ^-；pBS质粒DNA：购买或实验室自制。

2.实验设备

恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液枪。

3.实验试剂

（1）LB固体和液体培养基 1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，1%NaCl。固体培养基添加2%琼脂粉。

（2）Amp母液100mg/mL。

（3）含Amp的LB固体培养基 将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp储存液，使终浓度为50μg/mL，摇匀后铺板。

（4）0.1mol/L CaCl₂溶液 称取1.11g CaCl₂，溶于50mL重蒸水中，定容至100mL，高压灭菌。

（5）50%甘油。

4.操作步骤

（1）受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养12h左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1∶（50～100）的比例接种于100mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h，至OD₆₀₀为0.4～0.6。

（2）感受态细胞的制备（CaCl₂法）

①以接种环从-70℃保存的高效转化菌种中蘸取少量菌液划无抗生素LB平板，37℃培养12h。

②挑取单菌落接种于5mL无抗生素LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

③按照1∶100接种菌液至100mL LB培养基中，37℃剧烈振荡培养2～3h，至OD₆₀₀达0.4～0.6。

④将菌液冰浴10min，转移至预冷的50mL离心管中，4℃4000r/min离心10min。

⑤弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于20mL预冷的0.1mol/L CaCl₂中，冰浴20min，4℃4000r/min离心10min。

⑥弃上清，以5mL（菌液体积的5%）预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液重悬细菌沉淀，同时加入等体积预冷的50%甘油水溶液，混匀后按每支100μL在冰上分装，-70℃保存。

⑦感受态细胞的检测：取感受态细胞分别涂布含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的LB平板，37℃培养12～16h，观察感受态细胞是否有污染。

⑧取1μg超螺旋质粒转化制备的感受态，检测转化效率（一般情况下，没有必要精确计算，可根据经验估计）。

（3）转化

①从-70℃冰箱中取200μL感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。(www.xing528.com)

②加入pBS质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10μL），轻轻摇匀，冰上放置30min。

③42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却2min。

④向管中加入1mL LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Amp ^r）。

⑤将上述菌液摇匀后取100μL涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16～24h。

⑥同时做两个对照。

对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其他操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μL菌液涂布于不含抗生素的LB平板上。此组正常情况下应产生大量菌落。

（4）计算转化率

统计每个培养皿中的菌落数。

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子。根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：

转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积

转化频率（转化子数/每毫克质粒DNA）=转化子总数/质粒DNA加入量（mg）

感受态细胞总数=对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积/涂板菌液体积

感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数

5.注意事项

（1）原始菌种要保证质量。

（2）无菌操作，防止其他杂菌污染。

（3）细菌活化之后，生长密度最好保证OD₆₀₀为0.4～0.6。

（4）冰上分装感受态细胞，感受态细胞分装保存时不宜体积太大。

（5）在-70℃保存感受态细胞，至少半年仍然可有较好的转化效率，但也不宜过久。

（6）本实验方法也适用于其他E.coli受体菌株的不同质粒DNA的转化，但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板；而有的转化效率低，涂板时必须将菌液浓缩（如离心），才能较准确地计算转化率。