大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法

在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内。但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。转化（transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R^-，M^-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法[如电击法，CaCl₂、RbCl（KCl）等化学试剂法]的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（competent cell）。进入受体细胞的DNA分子通过复制表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl₂法和RbCl（KCl）法。RbCl（KCl）法制备的感受态细胞转化效率较高；但CaCl₂法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl₂法使用更广泛。

为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素。

1.细胞生长状态和密度

不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD₆₀₀来控制。DH5α菌株的OD₆₀₀为0.5时，细胞密度在5×10⁷个/mL左右（不同的菌株情况有所不同），此时用于制备感受态细胞比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。(www.xing528.com)

2.质粒的质量和浓度

用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA（cccDNA）。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μL的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。

3.防止杂菌和杂DNA的污染

整个操作过程均应在无菌条件下进行，使用新的离心管、枪头等，并经高压灭菌处理，所有的器皿和试剂都要灭菌，且注意防止被其他试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则会影响转化效率或造成杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。