质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段（＜10kb），质粒要比其他任何载体都好。在质粒载体上进行克隆，从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段，然后体外使两者相连接，再用所得到的重组质粒转化细菌，即可完成。但在实际工作中，如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例，可以将载体的自身环化限制在一定程度之下，也可以进一步采取一些特殊的克隆策略，如载体去磷酸化等，来最大限度地降低载体的自身环化，还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。
外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种。
1.带有非互补突出端的片段
用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生非互补的黏性末端，这也是最容易克隆的DNA片段。一般情况下，常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到具有与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。
2.带有相同黏性末端的片段(www.xing528.com)
用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到两个相同黏性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串联形成寡聚物，而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度，以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5′磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉，最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5′端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连，产生一个带有两个缺口的开环分子，在转入E.coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。
3.带有平末端的片段
由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比黏性末端要低得多，故在其连接反应中，T4DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇（PEG8000）以促进DNA分子凝聚成聚集体类物质，从而提高转化效率。特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配，则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头（linker）或衔接头（adapter）使其匹配，也可以有控制地使用E.coliDNA聚合酶Ⅰ的Klenow大片段部分填平3′凹端，使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。
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