常规PCR技术及其优化要点

1.概述

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤。①变性（denature）：目的双链DNA片段在94℃下解链；②退火（anneal）：两种寡核苷酸引物在适当温度下与模板上的目的序列通过氢键配对；③延伸（extension）：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环。理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达10⁶倍。

（1）PCR反应中的主要成分

①引物PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定，引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：a.引物长度为16～30bp，太短会降低退火温度，影响引物与模板配对，从而使非特异性增高；太长则比较浪费，且难以合成。b.引物中G+C含量通常为40%～60%，可按下式粗略估计引物的解链温度T_m=4（G+C）+2（A+T）。c.4种碱基应随机分布，在3′端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发。d.引物3′端最好与目的序列阅读框架中密码子第一位或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对。e.在引物内，尤其在3′端应不存在二级结构。两引物之间尤其在3′端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量；两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。f.引物5′端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制性内切酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等；通常应在5′端限制性酶切位点外再加 1～2个保护碱基。g.引物不与模板结合位点以外的序列互补。h.所扩增产物本身无稳定的二级结构，以免产生非特异性扩增，影响产量。i.简并引物应选用简并程度低的密码子，如选用只有一种密码子的Met，3′端应不存在简并性，否则可能由于产量低而看不见扩增产物。一般PCR反应中的引物终浓度为 0.2～1.0μmol/L，引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。

②4种三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）应用NaOH将dNTP pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5～10mmol/L并分装，-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为 20～200μmol/L。理论上 4种dNTP各 20μmol/L，足以在100μL反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。

③Mg²⁺Mg²⁺浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg²⁺浓度范围为0.5～2mmol/L。对于一种新的PCR反应，可以用0.1～5mmol/L的递增浓度的Mg²⁺进行预备实验，选出最适的Mg²⁺浓度。在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg²⁺浓度的物质，以保证最适的Mg²⁺浓度。

④模板PCR反应必须以DNA为模板进行扩增。模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子（线状分子比环状分子的扩增效果稍好）。就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中的模板数量为10²～10⁵个拷贝，对于单拷贝基因，需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA，扩增多拷贝序列时，用量更少。灵敏的PCR可从一个细胞、一根头发、一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。

⑤Taq DNA聚合酶一般Taq DNA聚合酶的活性半衰期为92.5℃ 130min，95℃40min，97℃5min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下可维持更长时间。Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下、30min掺入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为2×10 ^-4核苷酸/每轮循环，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意。在100μL PCR反应中，1.5～2U的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。所用的酶量可根据DNA、引物及其他因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验，需要预先灭活Taq DNA聚合酶。灭活Taq DNA聚合酶的方法有：a.PCR产物经酚∶氯仿抽提，乙醇沉淀；b.加入10mmol/L的EDTA螯合Mg²⁺；c.99～100℃加热10min。目前已有直接纯化PCR产物的试剂盒可用。

⑥反应缓冲液反应缓冲液一般含 10～50mmol/L Tris-HCl（20℃下pH 8.3～8.8），50mmol/L KCl和适当浓度的Mg²⁺。Tris-HCl在20℃时pH为8.3～8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8～7.8。50mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外，反应液可加入5mmol/L二硫苏糖醇（DDT）或100μg/mL牛血清白蛋白（BSA），它们可稳定酶活性。各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。

（2）PCR反应的参数

①变性在第一轮循环前，在94℃下变性5～10min非常重要，它可使模板DNA完全解链，然后加入Taq DNA聚合酶（hot start，即热启动），这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全，往往使PCR失败，因为未变性完全的DNA双链会很快复性，减少DNA产量。一般变性温度与时间为94℃、1min。在变性温度下，双链DNA解链只需几秒即可完全，所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含G+C的序列，可适当提高变性温度；但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。

②退火 引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成、引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度。实际使用的退火温度比扩增引物的T_m值约低5℃。一般当引物中G+C含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并，只用两种温度（如用60℃和94℃）完成整个扩增循环，既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒即可完成，反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。通常退火温度和时间为37～55℃，1～2min。

③延伸 延伸反应通常为72℃，接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃。实际上，引物延伸在退火时即已开始，因为Taq DNA聚合酶作用的温度范围可从20～85℃。延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。在一般反应体系中，Taq DNA聚合酶每分钟约可合成2kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对很低浓度的目的序列，则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后，都需要一步较长时间（8～10min）的延伸反应，以获得尽可能完整的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。

④循环次数 当其他参数确定之后，循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25～30轮循环已经足够。循环次数过多，会使PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经25～30轮循环扩增后，反应中Taq DNA聚合酶已经不足，如果此时产物量仍不够，需要进一步扩增，可将扩增的DNA样品稀释10³～10⁵倍作为模板，重新加入各种反应底物进行扩增，这样经60轮循环后，扩增水平可达10⁹～10¹⁰。扩增产物的量还与扩增效率有关，扩增产物的量可用下列公式表示：

C=C₀（1+P）ⁿ

式中，C为扩增产物量；C₀为起始DNA量；P为扩增效率；n为循环次数。

在扩增后期，由于产物积累，使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明显上升，这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。

（3）PCR产物的克隆

在许多研究中，需要将PCR产物克隆，以获得目的DNA片段。此时，所用PCR循环数应尽量小，以减少平台效应或非特异性扩增产物的干扰。通常将PCR产物插入到载体中，有下列一些方法。

①平末端连接 由于Taq DNA聚合酶往往在PCR产物3′端加上多余的非模板依赖碱基，在用平末端连接克隆PCR产物前，可用Klenow片段或T₄DNA聚合酶处理补平末端。

②在PCR产物尾部加dT或ddT Taq DNA聚合酶会在3′端加上多余的非模板依赖碱基，而且对A优先聚合，所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A。利用这一特点，可以经限制酶切割产生的平末端用酶加上dT或ddT，使载体与PCR产物末端互补并进行连接。载体末端加dT尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP或ddTTP，ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯键，保证在载体3′端只加上一个ddTTP，而其5′端所含的磷酸基团可与PCR产物的3′端OH连接，连接产物在载体和PCR产物之间的双链上带两个切口，这种重组DNA仍可转化合适的受体菌，并在细菌体内修复。目前一些公司已开发出可直接用于克隆PCR产物的T载体。

③黏性末端连接 利用引物中附加在5′端的限制性酶切位点，直接将PCR产物经适当的限制性酶切割后产生粘性末端，与载体连接，产生重组DNA。如果下游两个引物中含有两个不同的限制性酶切位点，经酶切后将定向克隆到载体中。

2.实验材料与试剂

（1）模板 不同来源的模板DNA。

（2）引物 上游引物和下游引物。

（3）Taq DNA聚合酶 3～5U/μL。(www.xing528.com)

（4）10×PCR缓冲液 100mmol/L Tris-HCl，15mmol/L MgCl₂，500mmol/L KCl，0.1%明胶，pH 8.3。

（5）dNTP混合液dATP，dTTP，dGTP，dCTP，各2.5mmol/L。

（6）水 要求不含DNA聚合酶抑制剂，不含离子，一般为去离子双蒸水（ddH₂O），灭菌以后即可使用。

（7）酚 4℃保存，不要接触皮肤。

（8）氯仿∶异戊醇配成24∶1的比例，室温避光保存。

（9）酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1。

（10）3mol/L NaAc。

（11）乙醇 70%乙醇，无水乙醇。

（12）TE缓冲液。

（13）模板DNA如基因组DNA（约0.5μg/μL为宜）。

（14）50×TAE每升含Tris 242g，冰乙酸57.1mL，Na₂EDTA·2H₂O 37.2g。

（15）5×TBE每升含Tris 54g，硼酸27.5g，0.05mol/L Na₂EDTA（pH 8.0）20mL。

（16）6×上样缓冲液。

3.实验仪器

PCR仪，离心机，琼脂糖凝胶电泳设备，紫外线检测仪，移液器等。

4.操作步骤

①在0.2mL PCR管中加入下列成分：10×PCR缓冲液，2.5μL；dNTP混合液，1μL；Taq DNA聚合酶，0.5μL；上游引物，0.5μL；下游引物，0.5μL；DNA模板，0.5μL；ddH₂O：补至25μL。

混匀后，在台式离心机上瞬时离心10s。

②在设定好的PCR仪上反应：95℃5min；95℃ 30s，50～60℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min。

③取一部分反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认是否有目的PCR产物。另外，DNA染色后，将PCR产物条带的浓度同分子质量标准条带的浓度进行比较，估算大致的DNA量。

如果PCR产物纯度较低或反应液中含有连接反应阻碍物，可以通过纯化得到改善，纯化见④～⑥。

④转至1.5mL离心管，向管中加25μL酚，25μL氯仿∶异戊醇混匀，10000r/min离心30s。

⑤吸取上层液，转至另一已加5μL 3mol/L NaAc的1.5mL离心管，加150μL无水乙醇，-20℃过夜。

⑥10000r/min离心10min，弃上清，加0.5mL 70%乙醇，10000r/min离心5min。弃上清，烤箱中干燥（60℃），溶于20μL TE缓冲液。