TaKaRaPrimeScriptTM双链cDNA合成试剂盒

关于cDNA合成的试剂盒很多，以TaKaRa PrimeScript^TM双链cDNA合成试剂盒为例说明。

（1）制品内容（10次量）

（2）试剂盒外所需试剂及仪器

试剂：10%（质量体积分数）SDS，0.25mol/L EDTA（pH 8.0），苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），氯仿∶异戊醇（24∶1），10mol/L乙酸铵，异丙醇，乙醇，TE。

仪器：微量离心机（微型离心机），水浴槽（PCR仪），微量移液枪及头，微量离心管。

1.cDNA第一条链合成

（1）在微量离心管中配制下列反应液，全量10μL。

（2）65℃保温5min后，冰上迅速冷却。

（3）配制以下反应液加入上述反应液中，全量20μL。

（4）轻柔搅拌混匀。

（5）42℃反应1h。

（6）反应结束后置于冰中冷却2min。

2.cDNA第二条链合成及末端平滑化

（1）在第一链cDNA合成反应后的微量离心管中按下列顺序配制合成cDNA第二条链的反应液，全量为142μL。

（2）加入2μLE.coliDNA聚合酶I以及2μLE.coliRNase H/E.coliDNA连接酶混合液，轻微搅拌。

（3）16℃反应2h。

（4）70℃加热10min。

（5）加入4℃的T₄DNA聚合酶，轻轻搅拌。(www.xing528.com)

（6）37℃反应10min。

（7）加入15℃的0.25mol/L EDTA（pH 8.0）以及15℃的10% SDS溶液搅拌，停止反应。

3.cDNA的精制

（1）反应停止后反应液总体积为180μL，加入等量（180μL）的苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）溶液，剧烈振荡5～10s混合。

（2）在室温下15000r/min离心1min，液体分为两层。小心取出水相（上层）移至另一个新的微量离心管中（注意切勿取出下层）。

（3）向水相中加入等量（180μL）的氯仿∶异戊醇（24∶1）溶液，剧烈振荡5～10s混合。

（4）在室温下15000r/min离心1min，液体分为两层。小心取出水相（上层）移至另一个新的微量离心管中。

（5）加入60μL的10mol/L CH₃COONH₄。

（6）加入2.5倍量的乙醇（600μL），充分混匀。

（7）室温下放置10min。

（8）在4℃下 15000r/min离心15min，除去上清。

（9）用70%乙醇清洗沉淀，在4℃下 15000r/min离心5min，除去上清。

（10）用适量的TE缓冲液溶解。

（11）-20℃保存。

思考题

1.为什么mRNA提取是cDNA合成成败的关键？

2.试比较自身引导法和置换合成法合成cDNA的优缺点？