植物病毒RNA提取实验步骤

大多植物病毒RNA为单链RNA，并且其极性与mRNA极性相同。植物病毒RNA提取较为简单，一般使用苯酚∶氯仿即可获得满意的结果。

1.实验材料

提纯的TMV病毒液（10mg/mL）。

2.实验设备

冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳仪，电泳槽。

3.实验试剂

苯酚∶氯仿（1∶1），氯仿，3mol/L NaAc（pH 5.2），乙醇（100%和70%），TE缓冲液，无RNA酶的无菌水。

4.操作步骤

步骤

（1）取一离心管加入提纯的TMV病毒液（10mg/mL）400mL，再加入等体积苯酚∶氯仿，盖紧管盖后用手充分振荡1min，4℃下12000×g离心10min。(www.xing528.com)

（2）吸取水相于一新离心管，再用苯酚∶氯仿抽提，直至水相和有机相交界面无蛋白为止。

（3）吸取水相于新离心管，加入等体积氯仿，用手倒置离心管数十秒，4℃下12000×g离心10min。

（4）取水相，加入1/10倍体积的3mol/L NaAc（pH 5.2），2.5倍体积的冰乙醇，混匀，-20℃放置30min。

（5）4℃下 12000×g离心 15min，小心弃去上清，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000×g离心5min。

（6）小心弃去上清，沉淀真空干燥5min或空气干燥10min，并溶于无RNA酶的无菌水或TE缓冲液中。

（7）取10mL进行电泳分析，另10mL用于cDNA合成。

注意事项

（1）整个操作应尽可能在低温下进行。

（2）由于病毒RNA镶嵌于外壳蛋白里面，因此要充分剥去病毒外壳蛋白，一般需要多次进行苯酚∶氯仿的抽提。