动植物组织mRNA提取实验

1.实验材料

水稻叶片或小鼠肝组织。

2.实验设备

研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，层析柱，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。

3.实验试剂

（1）无RNA酶的灭菌水 用高温烘烤的玻璃瓶（180℃处理2h）装蒸馏水，然后加入0.01%（体积分数）的DEPC，处理过夜后高压灭菌。

（2）75%乙醇用DEPC处理的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。

（3）1×层析柱加样缓冲液 20mmol/L Tris-HCl（pH 7.6），0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA（pH 8.0），0.1% SDS。

（4）洗脱缓冲液 10mmol/L Tris-HCl（pH 7.6），1mmol/L EDTA（pH 8.0），0.05% SDS。

（5）其他 氯仿，异丙醇，0.1mol/L NaOH，3mol/L NaAc（pH 5.2），冰乙醇。

4.操作步骤

（1）动植物总RNA提取——Trizol法Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern印迹分析、印迹杂交、poly（A）分离、体外翻译、RNase封阻分析和分子克隆。

步骤

①将组织在液氮中磨成粉末后，再以50～100mg组织加入1mL Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

②研磨液室温放置5min，然后以每毫升Trizol液加入0.2mL氯仿的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15s。

③取上层水相于一新的离心管，按每毫升Trizol液加0.5mL异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10min，12000×g离心10min。

④弃去上清，按每毫升Trizol液加入至少1mL的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500×g离心5min。

⑤小心弃去上清，然后室温或真空干燥5～10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

注意事项(www.xing528.com)

①整个操作要戴口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

②加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。

（2）mRNA提取 由于mRNA末端含有许多poly（A），当总RNA流经oligo（dT）纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在oligo（dT）纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。

步骤

①用0.1mol/L NaOH悬浮0.5～1.0g oligo（dT）纤维素。

②将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5～1.0mL，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。

③用1×层析柱加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH小于8.0。

④将上述（1）中提取的RNA液于65℃温育5min后迅速冷却至室温，加入等体积2×层析柱缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1×层析柱加样缓冲液。

⑤测定每一管的OD₂₆₀，当洗出液中OD₂₆₀为0时，加入2～3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3～1/2柱床体积分管收集洗脱液。

⑥测定OD₂₆₀，合并含有RNA的洗脱组分。

⑦加入1/10体积的3mol/L NaAc（pH 5.2），2.5倍体积的冰乙醇，混匀，-20℃放置30min。

⑧4℃下12000×g离心15min，小心弃去上清，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000×g离心5min。

⑨小心弃去上清，沉淀空气干燥10min，或真空干燥10min。

⑩用少量水溶解RNA，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。

注意事项

①mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

②oligo（dT）纤维素柱用后可用0.3mol/L NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮化钠（NaN₃）冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH水溶液和层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。