RNA提取和cDNA合成|分子微生物学实验指导

从真核生物的组织或细胞中提取mRNA，通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链，将双链cDNA和载体连接，然后转化扩增，即可获得cDN文库。构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析，比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之，cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自20世纪70年代首例cDNA克隆问世以来，已发展出了许多种提高cDNA合成效率的方法，并大大改进了载体系统，目前cDNA合成试剂已商品化。cDNA合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链，聚合酶合成cDNA第二链，加入合成接头以及将双链DNA克隆到适当载体（噬菌体或质粒）。

1.RNA制备

模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶，人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2h以上。凡是不能用高温烘烤的材料，如塑料容器等，皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液处理，再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应以抑制RNA酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。实验所用试剂也可用DEPC处理，加入DEPC至0.1%浓度，然后剧烈振荡10min，之后需要再煮沸15min或高压灭菌以消除残存的DEPC，否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。除DEPC外，也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。此外，为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需经硅烷化处理。

细胞内总RNA制备方法很多，如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒，可快速有效地提取到高质量的总RNA。分离的总RNA可利用mRNA 3′末端含有poly（A）的特点，当RNA流经oligo（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在oligo（dT）纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

2.cDNA第一链的合成

所有合成cDNA第一链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应。目前商品化的反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒（AMV）逆转录酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒（MLV）反转录酶。AMV反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基，这些活性包括依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的DNA合成以及对DNA∶RNA杂交体的RNA部分进行内切降解（RNA酶H活性）。MLV反转录酶只有单个多肽亚基，兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性，但降解RNA∶DNA杂交体中的RNA的能力较弱，且对热的稳定性较AMV反转录酶差。MLV反转录酶能合成较长的cDNA（如大于3kb）。

AMV反转录酶和MLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时的最适pH、最适盐浓度和最适温度各不相同，所以合成第一链时相应调整条件是非常重要的。AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3′端poly（A）结合的12～18核苷酸长的oligo（dT）以及随机引物。

3.cDNA第二链的合成

cDNA第二链的合成方法有以下两种。(www.xing528.com)

（1）自身引导法 该法合成的单链cDNA 3′端能够形成一短的发夹结构，这就为第二链的合成提供了现成的引物，当第一链合成反应产物的DNA∶RNA杂交链变性后，利用大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段或反转录酶合成cDNA第二链，最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环，即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA的5′端序列出现缺失和重排，因而该方法目前很少使用。

（2）置换合成法 该方法中，第一链在反转录酶作用下产生的cDNA∶mRNA杂交链不用碱变性，而是在dNTP存在下，利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口，从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。该反应有3个主要优点：① 非常有效；② 直接利用第一链反应产物，无需进一步处理和纯化；③不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。目前合成cDNA常采用该方法。

cDNA合成原理见图3-1、图3-2。

图3-1 使用oligo（dT）₁₈引物时的cDNA合成原理

图3-2 使用随机引物时的cDNA合成原理

4.cDNA的分子克隆

已经制备好的双链cDNA和一般DNA一样，可以插入到质粒或噬菌体中，为此，首先必须连接上接头（linker）。接头可以是限制性内切酶识别位点片段，也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴，退火后形成重组质粒，并转化到宿主菌中进行扩增。合成的cDNA也可以经PCR扩增后再克隆入适当载体。