丝状真菌基因组DNA制备实验

1.丝状真菌基因组的大量提取

（1）以每克经过滤抽干的菌丝体加4mL CTAB抽提液（2% CTAB；100mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；20mmol/L EDTA，pH 8.0；1.4mol/L NaCl），加入2-巯基乙醇（2-

ME）至终浓度为2%（体积分数）。

（2）菌丝体加入液氮冷冻，研磨至细小粉末状。把粉末加入到预热的2-ME/CTAB抽提液中，涡旋混匀，65℃保温45～60min，不时颠倒混匀。

（3）加入等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇溶液，颠倒混匀，12000r/min离心20min。

（4）取上层水相至另一离心管中，加入0.5～0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混匀，4℃放置20min，12000r/min离心10min。

（5）去上清，以70%乙醇洗涤沉淀两次，真空干燥后用适量TE缓冲液完全溶解。

（6）加入等体积冰预冷的5mol/L LiCl，混匀，12000r/min离心10min。

（7）转上清至另一新离心管中，加0.5～0.6倍体积冰冷的异丙醇，混匀，-20℃放置20min，12000r/min离心10min。(www.xing528.com)

（8）70%乙醇洗涤沉淀，真空干燥。

（9）以含50μg/mL RNase的超纯水完全溶解沉淀，37℃温育1h，-20℃保存备用。

2.丝状真菌基因组的小量提取

（1）约0.1g的菌丝体置于1.5mL的离心管中，加入300μL的提取缓冲液（100mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；100mmol/L EDTA；250mmol/L NaCl；1% SDS），用带塑料钻头的手持式电钻进行研磨约30s。

（2）加入等体积氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提，12000r/min离心15min。

（3）取上清，加入0.6倍体积异丙醇，混匀，-20℃放置20min，12000r/min离心10min。

（4）70%乙醇洗涤沉淀，真空干燥。

（5）以含50μg/mL RNase的超纯水完全溶解沉淀，37℃温育1h，-20℃保存备用。