植物组织基因组DNA提取实验

1.实验材料

水稻幼苗或其他禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。

2.实验设备

移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50mL离心管（有盖）及5mL和1.5mL离心管，弯成钩状的小玻璃棒。

3.实验试剂

（1）提取缓冲液Ⅰ 100mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5%SDS。

（2）提取缓冲液Ⅱ 18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0g PVP（聚乙烯吡咯烷酮），240μL巯基乙醇，加水至300mL。

（3）氯仿∶戊醇∶乙醇（80∶4∶16）。

（4）RNase A母液 10μg/μL。

（5）其他试剂液氮，异丙醇，TE缓冲液，无水乙醇，70%乙醇，3mol/L NaAc。

4.操作步骤

（1）水稻幼苗或其他禾本科植物基因组DNA提取。

①在50mL离心管中加入20mL提取缓冲液Ⅰ，60℃水浴预热。

②水稻幼苗或叶子5～10g，剪碎，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，剧烈摇动混匀，60℃水浴保温30～60min，不时摇动。

③加入20mL氯仿∶戊醇∶乙醇溶液，颠倒混匀（需戴手套，防止损伤皮肤），室温下静置5～10min，使水相和有机相分层。

④室温下5000r/min离心5min。

⑤仔细移取上清至另一50mL离心管，加入1倍体积的异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。(www.xing528.com)

⑥在1.5mL EP管中加入1mL TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团，在干净吸水纸上吸干，转入含TE的离心管中，DNA很快溶解于TE。

⑦如DNA不形成絮状沉淀，则可用5000r/min离心5min，再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在60℃水浴放置15min以上，以帮助溶解。

⑧将DNA溶液3000r/min离心5min，上清倒入干净的5mL离心管。

⑨加入5μL RNase A（10μg/μL），37℃ 10min，除去RNA（若RNA对DNA的操作、分析无影响，可省略该步骤）。

⑩加入1/10体积的3mol/L NaAc及2倍体积的冰乙醇，混匀，-20℃放置20min左右，DNA形成絮状沉淀。

⑪用玻璃棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。

⑫将DNA重溶解于1mL TE，-20℃ 贮存。

⑬取2μL DNA样品在0.7%琼脂糖胶上电泳，检测DNA的分子大小。同时取15μL稀释20倍，测定OD₂₆₀/OD₂₈₀，检测DNA含量及质量。

（2）从李（苹果）叶子提取基因组DNA。

①取3～5g嫩叶，液氮磨成粉状。

②加入提取缓冲液Ⅱ 10mL，再研磨至溶浆状。10000r/min离心10min。

③去上清，沉淀加提取缓冲液Ⅰ20mL，混匀。65℃水浴30～60min，常摇动。

④同本节（1）中步骤③～⑬操作。

5.注意事项

5g样品可保证获得500μg DNA，足供RFLP、PCR等分析之用。