细菌真菌耐药监测-分子生物学方法

世界卫生组织（WHO）将耐药结核病描述为“影响结核病控制的主要公共健康威胁”。全世界每年发生约50万例多重耐药结核病。由于结核分枝杆菌复合群生长缓慢，收到标本后可能需要四周或更长时间才能获得基于培养的抗菌药物敏感性测试结果。在等待基于培养的抗菌药敏试验结果的同时，患者可能接受无效或欠优化的方案治疗，可能产生耐药性。尽早了解耐药状态以防止治疗失败至关重要。在过去的二十年中，用于检测耐药性的分子技术得到了改善。在医学或公共卫生实验室中纳入基于分子的抗菌药物敏感性试验（mAST）已经取得了显著改善耐药性结核患者临床管理的结果。与传统药敏试验（c AST）相比，mAST结果的周转时间能从几周减少到1～2 d甚至几小时。虽然建议使用核酸扩增试验来帮助疑似结核病患者进行初步诊断，但在耐药性结核患病率较低的地区，mAST可能并非必需。进行mAST的推荐原则如下。

（1）患者来自耐药性结核病患病率高的地区。

（2）患者与耐药性结核病患者有接触。

（3）患者对重要的抗结核药物有不良反应，需要测试替代药物的敏感性。

（4）患者对治疗没有反应或之前接受过抗结核病治疗。

（5）患者广泛接触他人或可能接触弱势群体。

（6）公共暴露场所可能包括学校、医疗保健设施、辅助生活设施、监狱等。

（7）弱势群体可能包括幼儿、老人、免疫力低下者等。

（8）混合培养。

（9）涂片阳性但是培养不生长。

（10）由于培养基营养不足导致c AST失败。

目前，结核病的耐药基因检测技术均是从基因突变与耐药性的关系着手，从而为结核病的分子药敏检测提供依据。通常，mAST可以分为两种主要类型：基于测序的方法和基于探针的方法。两种类型之间的主要区别在于测序方法提供特定的核苷酸序列结果，不论是野生型或突变型。因为突变并不总是赋予药物抗性并且抗性水平可能不同，所以当检测到突变的核苷酸序列时，重要的是知道突变的核苷酸序列相关的抗药性水平。当mAST测定足够灵敏以直接测试患者的原始样本或来自处理样本的沉淀物时，mAST的益处进一步最大化。目前，常用的结核病耐药基因检测技术主要包括半巢式全自动实时荧光定量PCR检测、线性探针技术、熔解曲线以及DNA 微阵列芯片等，Sanger测序、焦磷酸测序、全基因组测序和宏基因组测序技术也在快速发展应用中。

（一）Xpert MTB／RIF半巢式全自动实时荧光定量PCR检测

该技术针对r poB基因81 bp利福平耐药核心区间（RRDR）设计引物探针，检测其是否发生突变，进而用于诊断患者是否患有结核病以及是否对利福平耐药，操作简单安全，即时检测2 h出报告。

世界卫生组织（WHO）自2010年起就推荐其作为活动性结核病及利福平耐药的快速诊断方法，尤其是对结核高负担国家应作为结核快速检测及耐多药结核（MDRTB）快速筛查的首选检测方法进行使用。Xpert MTB／RIF已被列入我国结核病诊疗指南并作为活动性结核病的诊断标准之一。具体操作步骤如下。

1.痰样本收集每份样品需收集至少1 ml痰液。

2.痰沉淀处理步骤

（1）将痰样本加于50 ml带有螺旋盖的前处理管，将1～2倍体积的样品处理试剂（SR）加入前处理管中，剧烈振摇10～20次。

（2）样本在室温下静置15 min。在Xpert MTB／RIF检测匣侧壁标记样本序号（ID），将液化的样品吸入，直至弯月面在移液管的最低标记之上。如果样品量不足，不要进行下一步。

（3）打开检测匣的盖子，将处理后的样品由检测匣的加样孔缓慢加入。注意：缓慢加入，防止气溶胶形成。

（4）关闭检测匣的盖子，确保盖子关紧。其余液化样本可以保存在2～8℃达12 h，以备重复检测使用。

3.启动测试

（1）使用用户名及密码登录GeneXpert软件。

（2）点击GeneXpert系统窗口上的“创建测试”，扫描或输入患者ID，扫描或输入样品ID，扫描Xpert MTB／RIF Assay检测盒上的条码。点击“开始测试”。

（3）开启仪器模块门，加载检测盒。关闭模块门，测试开始。

（4）测试结束后，绿灯关闭。待系统释放门锁后，再打开模块门，然后取出检测盒。根据所在机构的标准做法，将用过的检测盒置入适当的标本废物箱中予以丢弃。

4.结果解释Xpert MTB／RIF检测结果通过GeneXpert System测量荧光信号和内设的计算算法来判定，由系统直接报告结果，并在“预览结果”（View Results）窗口显示。较低的Ct值代表了较高的DNA模板起始浓度；较高的Ct值代表了较低的DNA模板浓度。

（二）线性探针技术

线性探针技术将PCR 扩增、反向杂交、膜显色技术合为一体，通过引物扩增目的片段，扩增产物与膜上固定的特异性探针杂交，杂交物通过酶显色反应判断结果。WHO 2008年推荐线性探针用于MDR-TB的快速检测，2016年首次针对XDR-TB推荐线性探针法。

线性探针的整个过程分为三个步骤：首先，从临床痰样本（去污染）或痰培养物（固体／液体培养基）提取DNA——提供所需的裂解缓冲液（A-LYS）和中和缓冲液（ANB）。其次，用生物素标记的引物进行多重扩增。最后，反向杂交。具体操作步骤如下。

1.DNA提取　消化处理后的痰样本以及在固体培养基上（如罗氏培养基、Middlebrook培养基）或液体培养基（如BACTEC、MB-Check）生长的痰培养物均可进行DNA提取。操作区域必须无DNA污染。

2.扩增按照试剂说明书要求设置扩增反应程序。扩增产物可保存于-20℃至8℃。

3.杂交使用的相应的杂交仪，按照设定的程序进行杂交、显色。

4.结果解释粘贴探针膜条并避光保存。试剂盒中备有结果判读表。使用该判读表时，将得到的探针膜条粘贴到指定位置，将CC和AC条带与表中各自对应的线进行对齐。由于技术原因，各条带之间的距离可能会有所不同。为了准确判读，请使用提供的模板并调整探针膜条，使每个位点与各自的位点对照带对齐。确定耐药情况并分别记录在各自框内。一个探针膜条里的所有条带不一定都会出现相同的信号强度。每个探针膜条都有27个反应区（见图8-2-1）。

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图8-2-1　线性探针技术探针膜条解释图

注：显示的探针膜条不是原物大小

（三）荧光PCR熔解曲线法

该技术采用荧光PCR熔解曲线法，其基本原理是：在PCR体系中加入两端分别标记有荧光基团与淬灭基团的探针，在PCR过程中扩增出与探针序列互补的单链寡核苷酸序列，在扩增完成后增加熔解曲线分析过程，同时实时监测荧光值的变化，通过计算荧光值与温度的负导数，可获得探针与该序列杂交产物的熔解曲线，并得出熔点（Tm 值），从而推得该序列突变信息。如果靶序列与探针完全匹配，则探针与该序列杂交的熔点最高；如果探针与序列不完全匹配，例如序列发生点突变、插入或者缺失，则探针与该序列杂交的熔点低于探针与完全匹配序列杂交的熔点。熔点的降低程度与点突变类型、插入或缺失碱基数量以及突变位点的位置有关。

荧光PCR熔解曲线法在检测灵敏度、特异性和检测时间上保持了实时PCR的优势，同时与探针熔解曲线分析结合，使得该技术又实现了简单操作、低成本和低污染的目的。系列产品具有以下几个方面的特点。①检测快速：在获得样本后，2～3 h即可完成检测。②结果准确：整个检测过程闭管完成，无PCR后处理，避免了假阳性的出现。③操作简便：仪器自动判读结果，操作步骤少，且易于掌握。④全面覆盖：可实现MDR-TB和XDR-TB一步检测，包含6种主要的抗结核一线药和二线药耐药检测。

具体操作步骤如下。

1.样本预处理不同的样本类型提取方法略有不同，详见试剂说明书。

2.仪器提取按核酸提取仪器操作规程进行操作。

3.耐药突变检测首先将所有的试剂从冰箱取出并平衡至室温。按照说明书配制PCR反应液，以每管20μl分装于PCR薄壁反应管。用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的提取样品或阴／阳性对照品5μl。立即盖严管盖。将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区。配置好的PCR管上机检测。

4.仪器自动判读结果。

（四）DNA微阵列芯片

该技术采用原位合成，将DNA 探针固定化于支持物表面上，产生二维DNA 探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现检测。该方法能同时检测利福平、异烟肼耐药性相关基因r poB／kat G／inh A的基因突变。

基因芯片操作主要包括以下步骤：样品制备（DNA 提取和PCR扩增），杂交清洗（芯片杂交和清洗干燥）以及结果判读。具体操作步骤如下。

1.DNA提取向核酸提取管中加入80μl核酸提取液，提取固体培养基、液体培养基或者液化的痰标本的核酸（具体的提取方法此处不作介绍），得到的核酸放置-20℃环境中暂存（不超过2个月）。

2.PCR扩增按照结核耐药检测PCR扩增程序进行PCR扩增。将离心管或八连排管置于PCR扩增仪中，进行PCR扩增反应。

3.芯片杂交

（1）取出PCR产物，按照9μl杂交缓冲液、3μl+3μl PCR产物的比例配制杂交混合物。

（2）将杂交缓冲液，50℃热浴10 min；将PCR产物置于PCR仪中95℃变性5 min，随后立即置于冰水混合物中骤冷冰浴3 min。

（3）按照杂交盒（两端底部各加100μl蒸馏水，防止杂交过程中芯片干燥）、托架、芯片、盖片的顺序装配好杂交反应盒。

（4）吸取13.5μl杂交混合物经加样孔加入芯片点阵中，盖好盒盖并使用金属封条密封杂交盒。

（5）50℃预热芯片杂交仪20 min以上，完成后将杂交盒平稳放入杂交仪托盘，并注意将三只或六只杂交盒全部放入，以使托盘平衡。

（6）运行结核耐药芯片杂交程序，杂交条件为50℃杂交2 h，转速为5rpm。

4.清洗干燥

（1）配制洗液Ⅰ和洗液Ⅱ。

（2）预热芯片洗干仪，待仪器屏幕显示“请放入芯片进行洗涤”的对话框时即可放入完成杂交的芯片，运行结核耐药芯片洗涤程序进行洗涤，待洗涤完成后仪器屏幕显示“请将芯片放入甩干仓”时，即可将芯片对称的放入甩干仓，点击确定开始甩干。

5.结果判读

（1）开启扫描仪，运行结核分枝杆菌耐药检测芯片判别系统，预热激光10 min。

（2）将完成洗涤、甩干的芯片插入扫描仪插槽内，即可进行芯片扫描和结果判读。

（3）完成判读的芯片需室温避光保存，并请详细记录判读结果和芯片信息。

（五）基于DNA测序的分子药敏检测

Xpert MTB／RIF可以鉴定结核分枝杆菌复合群并确定r poB基因的RRDR处是否存在突变，但是不能提供与突变相关的任何核苷酸序列。目前已知r poB中沉默突变的存在，可能被误判为耐利福平。因此，基于DNA测序的分子药敏检测在识别突变位点上具有不同优势，见表8-2-10。

表8-2-10　DNA测序技术比较

（作者：余方友　校审：吴文娟）