氨基糖苷类抗生素通过作用于细菌核糖体，抑制其蛋白质合成，从而破坏其细胞膜完整性而杀灭细菌。由于这类药物具杀菌作用，抗菌谱广，有较长的抗生素后效应，与其他抗菌药物有协同作用，目前是治疗革兰阳性及阴性菌感染，尤其是耐多药革兰阴性菌感染常用的联合治疗药物。但随着这类药物的临床应用，细菌对其耐药率也持续上升。细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药机制主要有3种。①细菌外膜蛋白通透性改变或细胞内膜转运异常，使药物在菌体内的蓄积减少。②产生氨基糖苷类钝化酶包括氨基糖苷类乙酰转移酶、磷酸转移酶及核苷转移酶。③核糖体蛋白或16SrRNA 突变，使药物作用靶位改变，药物进入细菌后不能有效地与核糖体结合而产生耐药。过去认为，产生钝化酶是最常见的耐药机制，因钝化酶具有底物特异性，细菌对氨基糖苷类不同品种呈现不完全交叉耐药。2003年法国学者在临床分离的耐多药肺炎克雷伯菌中发现了一种由质粒介导的耐药机制——16S rRNA甲基化酶（16S rRNA methy lase），该酶导致革兰阴性杆菌对卡那霉素组和庆大霉素组的多种临床常用氨基糖苷类抗生素高度耐药。目前已发现的16S rRNA甲基化酶基因包括rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、rmtF、rmtG、rmtH、npmA和armA等。多重PCR检测rmt基因的引物序列见表6-4-5。
表6-4-5 多重PCR检测质粒介导氨基糖苷类耐药基因的引物序列
（续表）
检测步骤如下。
1.煮沸法提取细菌DNA取过夜纯培养细菌单一菌落于500μl TE缓冲液中，100℃加热13 min，10 000 r／min离心1 min，上清液即为PCR 反应的DNA模板。
2.PCR反应体系50μl。其中10×Buffer 5μl，d NTP 4μl，引物各1μl，DNA 聚合酶0.25μl，无菌水32.75μl，DNA 模板2μl。引物序列及扩增片段长度见上页表6-4-5。(www.xing528.com)
3.PCR反应条件①预变性：96℃×5 min；②循环：96℃×30 s，55℃×30 s，72℃×1 min，共30个循环；③延伸：72℃×5 min；④4℃保存。
4.PCR产物电泳1.2%琼脂糖凝胶，电压120 V，电泳时间40 min。最后经溴乙锭染色后在凝胶成像系统上阅读结果（图6-4-6）。
图6-4-6 多重PCR检测细菌中的质粒介导氨基糖苷类耐药基因
泳道1：rmtB；泳道2：rmtC；泳道3：armA；泳道4：rmtA；泳道5：rmtD；M：分子量marker
（作者：胡付品 校审：朱德妹）
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