质粒介导喹诺酮类耐药基因的检测方法

早期研究发现，细菌对喹诺酮类的耐药机制主要为靶位改变和主动外排，两者均为染色体介导，近年发现了与前两者完全不同的由质粒介导耐药机制，且在越来越多的临床菌株中得以证实。1998年Jacoby实验小组自1株肺炎克雷伯菌临床分离菌中获得1个耐药质粒，将该质粒转移至其他细菌时，细菌对喹诺酮类的最低抑菌浓度上升4～16倍，这提示存在质粒介导的耐药。随后耐药基因被克隆出来，命名为qnr（由于之后又发现更多的qnr 类似的基因，故将其命名为qnr A）。随着研究的深入，越来越多的qnr 基因不断被发现，目前至少已发现6种qnr 基因，包括qnr A、qnr B、qnr C、qnr D、qnr E和qnr S等。多重PCR检测qnr基因的引物序列见表6-4-4。

表6-4-4　多重PCR检测qnr基因的引物序列

图6-4-5　多重PCR检测细菌中的qnr A、qnr B 和qnr S 基因

泳道1：阴性对照；泳道2：qnr S阳性对照；泳道3：qnr B和qnr S 阳性对照；泳道4～6：临床分离株qnr B和qnr S基因阳性；泳道7～8：临床分离株qnr A和qnr S 基因阳性；泳道9：临床分离株qnr S 基因阳性(www.xing528.com)

检测步骤如下。

1.煮沸法提取细菌DNA　取过夜纯培养细菌单一菌落于500μl TE 缓冲液中，100℃加热13 min，10 000 r／min离心1 min，上清液即为PCR反应的DNA模板。

2.PCR反应体系50μl。其中10×Buffer 5μl，d NTP 4μl，引物各1μl，DNA聚合酶0.25μl，无菌水32.75μl，DNA 模板2μl。引物序列及扩增片段长度见表6-4-4。

3.PCR反应条件　①预变性：95℃×10 min；②循环：95℃×1 min，54℃×1 min，72℃×1 min，共35个循环；③延伸：72℃×10 min；④4℃保存。

4.PCR产物电泳1.2%琼脂糖凝胶，电压120 V，电泳时间40 min。最后经溴乙锭染色后在凝胶成像系统上阅读结果（图6-4-5）。