碳青霉烯酶基因快速检测-实用手册

碳青霉烯酶是一种能水解碳青霉烯类抗菌药的β-内酰胺酶，在Ambler分子分类法中属于A、B、D类酶，主要的碳青霉烯酶基因及其引物序列如表6-4-3所示。

表6-4-3　碳青霉烯酶基因引物序列

（续表）

（续表）

检测步骤如下。(www.xing528.com)

1.煮沸法提取细菌DNA取过夜纯培养细菌单一菌落于500μl TE 缓冲液中，100℃加热13 min，10 000转／min离心1 min，上清液即为PCR反应的DNA模板。

2.PCR反应体系50μl。其中10×Buffer 5μl，d NTP 4μl，引物各1μl，DNA 聚合酶0.25μl，无菌水36.75μl，DNA模板2μl。

3.PCR反应条件①预变性：94℃×5 min；②循环：94℃×45 s，（50～55）℃×45 s，72℃×1 min，共30个循环；③延伸：72℃×10×min；④4℃保存。多重PCR检测鲍曼不动杆菌中的OXA型酶基因的反应条件为：①变性：94℃×5 min；②循环：94℃×25 s，52℃×40 s，72℃×50 s，共30个循环；③延伸：72℃×6 min。

4.PCR产物电泳1.2%琼脂糖凝胶，电压120 V，电泳时间40 min。最后经溴乙锭染色后在凝胶成像系统上阅读结果（图6-4-4）。

图6-4-4　PCR检测碳青霉烯酶基因

1.blaKPC 阳性对照；2.blaNDM 阳性对照；3.blaOXA阳性对照；4.blaIMP阳性对照；5.blaKPC阳性肺炎克雷伯菌；6.blaKPC 阳性大肠埃希菌；7.blaNDM阳性肺炎克雷伯菌；8.blaNDM阳性大肠埃希菌；9.blaOXA-4B 阳性肺炎13.blaKPC 阴性对照；14.blaNDM阴性对照；15.blaOXA-4B 阴性对照；16.blaIMP 阴性对照；M.分子量marker克雷伯菌；10.blaOXA4B阳性肺炎克雷伯菌；11.blaIMP阳性肺炎克雷伯菌；12.blaIMP阳性阴沟肠杆菌；