万古霉素耐药肠球菌耐药基因可分为Van A、Van B、Van C、Van D、Van E、VanG、Van L和Van M 等8种型别，不同耐药基因的耐药特征有所差异（表6-3-1）；Van D、Van E、VanG、VanL和Van M 基因较少见。可采用单重PCR 对这几种耐药基因进行检测，亦可采用多重PCR-RFLP方法检测肠球菌中的Van A、Van B和VanC基因（下页表6-3-2）。检测步骤如下。
表6-3-1 不同基因型耐药肠球菌的表型特点
（续表）
表6-3-2 多重PCR RFLP检测耐万古霉素肠球菌的引物序列
1.煮沸法提取细菌DNA取过夜纯培养细菌单一菌落置于500μl TE缓冲液中，100℃加热13 min，10 000 r／min离心1 min，上清液即为PCR 反应的DNA模板。(www.xing528.com)
2.多重PCR反应体系 共50μl。其中10×Buffer 5μl，d NTP 4μl，引物各1μl，DNA聚合酶0.25μl，无菌水30.75μl，DNA模板2μl。引物序列及扩增片段长度见表6-3-2。
3.PCR反应条件①预变性：95℃×10 min；②循环：94℃×1 min，56℃×1 min，72℃×1 min，共35个循环；③延伸：72℃×5 min。PCR反应结束后，每个PCR反应管中加入MspI（10 U／ml）限制性内切酶1μl和10×Buffer 5μl，13 200 g离心20 s后37℃孵育过夜。
4.限制性内切酶消化后的PCR 产物电泳3%琼脂糖凝胶，电压110 V，电泳时间45 min。最后经溴乙锭染色后在凝胶成像系统上阅读结果（下页图6-3-2），与相应的van A、van B、vanC-1 和van C-2阳性质控菌株进行对比后确定基因型别。
图6-3-2 PCR-RFLP检测肠球菌中的万古霉素耐药基因
泳道2、3和10：无限制性片段产物；泳道6和11：van A基因；泳道1、4、5、7、8、9、12和13：van B 基因；泳道14：vanC 1 基因；泳道15：vanC-2 基因；泳道16：非van A、vanB和vanC耐药基因的限制性片段；泳道17：DNA分子量marker
（作者：胡付品 校审：朱德妹）
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