碳青霉烯酶是指能够水解碳青霉烯类抗菌药如亚胺培南和美罗培南等的一类β-内酰胺酶，包括Ambler分子分类中的A、B和D类酶（下页表6-2-1）。A 类酶的活性中心为丝氨酸结构，可被硼酸类化合物所抑制，而不被乙二胺四乙酸（EDTA）抑制；B类酶为金属酶，该酶活性可被EDTA所抑制，但不被硼酸类化合物所抑制；D 类酶主要为OXA型碳青霉烯酶，我国临床分离株主要产生OXA-181或OXA-232型碳青霉烯酶。目前检测碳青霉烯酶的表型方法主要有以下几种：Car ba NP试验、碳青霉烯灭活试验（mCIM、eCIM）和酶抑制剂增强试验。
1.Carba NP试验CLSI于2015年引入Carba NP试验，用于检测肠杆菌目、铜绿假单胞菌和不动杆菌属细菌中碳青霉烯酶的表型确证试验。该试验采用比色法，目前主要用于流行病学研究或感染控制。研究表明，Carba NP试验在检测KPC、NDM、VI M、IMP、SPM和SME型碳青霉烯酶方面具有较好的敏感性（＞90%）和特异性（＞90%）。2016年最新发布的CLSI文件中，对此试验做了部分更新。Carba NP试验的试剂配制、操作步骤和结果阅读分别见表6-2-1、表6-2-2和下页图6-2-6。
表6-2-1 Carba NP试验试剂的配制
表6-2-2 Carba NP结果解释
2.mCIM和eCIM试验碳青霉烯灭活方法（carbapenem inactivation method，CIM）是2016年CLSI最新推荐的用于检测革兰阴性杆菌中的碳青霉烯酶的方法，之后为了检测细菌产生的金属酶，在此基础上发展了eCIM试验。mCIM与eCIM联合可检测细菌产生的A类或B类碳青霉烯酶。其原理是将待测菌菌悬液与美罗培南纸片共孵育，若待测菌产生碳青霉烯酶，该酶可水解纸片上的美罗培南使之失效，不能抑制大肠埃希菌ATCC 25922的生长。若待测菌不产碳青霉烯酶，纸片上的美罗培南仍保持抗菌活性，从而抑制大肠埃希菌ATCC 25922的生长。mCIM 试验操作过程如图6-2-7所示。
图6-2-6 Carba NP检测碳青霉烯酶
图6-2-7 mCIM 试验操作过程
A.10μl接种环取出美罗培南纸片；B.将纸片贴于试管内壁并挤去多余水分；C.用接种环取出纸片；D.将纸片贴于已涂布有大肠埃希菌ATCC 25922的MHA平板上
（1）mCIM 实验操作步骤
1）取1μl接种环满环（肠杆菌目细菌）或10μl接种环满环（铜绿假单胞菌）的生长于血琼脂平板上的过夜培养纯菌落，于2 ml TSB肉汤中震荡混匀10～15 s。
2）每管放入一张含10μg美罗培南的无菌纸片，确认纸片浸没于菌悬液中。
3）（35±2）℃大气环境孵育4 h±15 min。
4）孵育结束时，立即用营养肉汤或生理盐水制备0.5麦氏浊度的大肠埃希菌ATCC 25922悬液，菌悬液制备和平板涂布需15 min内完成，干燥3～10 min。
5）用10μl接种环将美罗培南纸片从TSB肉汤中取出，将纸片贴于试管内壁，轻轻按压以挤去纸片上多余水分，然后将纸片取出贴于已涂布有大肠埃希菌ATCC25922的MHA平板上。100 mm 的MHA平板最多贴4张纸片，150 mm 的MHA 平板最多贴8张纸片。
6）倒置平板，（35±2）℃大气环境孵育18～24 h，量取抑菌圈直径。
（2）eCIM 实验操作步骤
1）取第二支含2 ml TSB肉汤的管，管壁上标记细菌名称；加入20μl 0.5麦氏浊度的EDTA溶液于2 ml TSB肉汤中，EDTA最终浓度为5 m M。(www.xing528.com)
2）剩下步骤同mCIM 实验步骤“1）～6）”。mCIM 和eCIM 实验同步进行。
3）mCIM 和eCIM 实验管中的美罗培南纸片贴于同一块已涂布有大肠埃希菌ATCC 25922的MHA平板上。
（3）mCIM 结果解释（图6-2-8）
图6-2-8 mCIM 和eCIM 检测细菌产生的碳青霉烯酶
1）碳青霉烯酶阳性：美罗培南抑菌圈直径为6～15 mm 或直径为16～18 mm，但抑菌圈内有散在菌落。若待测株产生碳青霉烯酶，纸片中的美罗培南被该酶降解，结果为无抑菌圈或抑制大肠埃希菌ATCC 25922的活性降低。
2）碳青霉烯酶阴性：抑菌圈直径≥19 mm。若待测菌株不产碳青霉烯酶，纸片中的美罗培南不被水解，仍能抑制大肠埃希菌ATCC 25922的生长。
3）碳青霉烯酶中性：抑菌圈直径为16～18 mm 或直径为≥19 mm，但抑菌圈内有散在菌落。无法判断是否存在碳青霉烯酶。
（4）eCIM 结果解释（图6-2-8）
1）金属酶阳性：与mCIM结果相比，美罗培南抑菌圈直径≥5 mm（如mCIM=6 mm，eCIM=15 mm，抑菌圈直径之差为9 mm）。对于eCIM，忽略任何抑菌圈内的散在针尖样菌落。若待测株产生金属酶，与不含EDTA管相比，该酶活性将被EDTA抑制，纸片中的美罗培南未被细菌产生的金属酶充分水解，美罗培南仍能抑制大肠埃希菌ATCC 25922的生长，进而出现抑菌圈。
2）金属酶阴性：与mCIM结果相比，美罗培南抑菌圈直径≤4 mm（如mCIM=6 mm，eCIM=8 mm，抑菌圈直径之差为2 mm）。对于eCIM，忽略任何抑菌圈内的散在针尖样菌落。若待测株产生丝氨酸碳青霉烯酶，该酶活性将不受EDTA 影响。含与不含EDTA管，美罗培南的抑菌圈直径无差别或≤4 mm。
3.酶抑制剂增强试验 受试菌菌液制备和涂布同标准的纸片扩散法，在MH 平板上贴上四张亚胺培南纸片（30μg），纸片中心距离为25 mm。除一张亚胺培南纸片外，在其他三张亚胺培南纸片上分别滴加10μl 0.1 mol／L的EDTA 溶液、6μl 50 mg／ml的3-氨基苯硼酸（APB）溶液、10μl 0.1 mol／L的EDTA溶液+6μl 50 mg／ml的APB溶液。35℃孵育过夜后阅读结果。若含酶抑制剂与单药抑菌圈直径相差5 mm 者，判断该菌产生碳青霉烯酶，反之为阴性。利用EDTA可抑制金属酶的活性、3-氨基苯硼酸可抑制A类碳青霉烯酶的活性的特点，本方法可同时检测细菌产生的A类、B类碳青霉烯酶（图6-2-9）。
图6-2-9 EDTA和APB联合检测碳青霉烯酶
A.产KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌；B.产NDM-1型金属β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌；C.同时产KPC-2和NDM-1型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌；1.亚胺培南；2.亚胺培南+EDTA；3.亚胺培南+APB；4.亚胺培南+EDTA+APB
4.OXA-48型碳青霉烯酶的检测 与A 类、B类碳青霉烯酶相比，D类OXA-48型碳青霉烯酶的检测方法不多。Tsakris等推荐采用改良Hodge试验与酶抑制剂相结合的方式，用于肠杆菌目细菌中OXA-48 型碳青霉烯酶的检测，其检测灵敏度可达96.3%。试验方法简单描述如下：在涂布有大肠埃希菌ATCC 25922的平板上贴三张美罗培南或亚胺培南纸片，然后分别用单含EDTA和同时含EDTA 和APB的空白纸片刮取待测菌菌落，紧贴于美罗培南或亚胺培南纸片，35℃过夜孵育后阅读结果（图6-2-10）。结果判读如下：① 若大肠埃希菌在单含EDTA、同时含EDTA 和APB纸片周围生长，提示该菌产OXA-48型碳青霉烯酶；②若大肠埃希菌在单含EDTA 和同时含EDTA 和APB纸片周围均不生长，提示该菌产NDM型金属β-内酰胺酶；③若大肠埃希菌仅在单含EDTA纸片周围生长，但在同时含EDTA 和APB纸片周围不生长，提示该菌产KPC型碳青霉烯酶。
图6-2-10 联合纸片法检测OXA-48型碳青霉烯酶
A：OXA-48型碳青霉烯酶阳性株；B：NDM-1阳性菌株；C：KPC-2型碳青霉烯酶阳性株
（作者：胡付品 校审：朱德妹）
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