利用AmpC酶的特性进行细菌检测方法

产生Amp C酶是革兰阴性杆菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的另一种主要机制，Amp C酶按Bush分类属于第一组，Amber分类属C类酶，有染色体介导和质粒介导两种。与ESBLs不同的是，Amp C酶能水解第三代头孢菌素但第四代头孢菌素头孢吡肟对其稳定，Amp C酶的活性不被克拉维酸、他唑巴坦或舒巴坦抑制，但可被氯唑西林和硼酸或阿维巴坦所抑制。利用Amp C酶的特性，实验室可设计相应实验来检测细菌产生的Amp C酶，主要有以下两种方法。

（1）硼酸抑制试验（图6-2-4）：标准纸片法药敏试验，平板上贴两张头孢他啶（或头孢噻肟）纸片间距为25 mm，在其中一张头孢他啶（或头孢曲松）纸片上加3-氨基苯硼酸溶液（终浓度为30μg／片）。35℃孵育18～20 h后观察结果。含酶抑制剂与单药抑菌圈直径相差≥5 mm，即判定该菌株产Amp C酶。

图6-2-4　硼酸抑制试验检测Amp C酶

（2）三维试验（图6-2-5）：三维试验检测Amp C酶步骤如下。

图6-2-5　三维试验检测Amp C酶(www.xing528.com)

1和3为阳性结果，2和4为阴性结果，中间FOX为头孢西丁纸片

1）酶粗提液提取：将过夜增菌后的菌体悬浮于pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，反复冻融或超声粉碎法裂解细菌细胞以释放其中的β-内酰胺酶，高速离心后上清液即为酶粗提液。

2）按K-B法制备MH平板，涂布敏感菌株ATCC 25922（一维），在平板中央贴上头孢西丁纸片（二维），从距离纸片5 mm处用无菌刀片在平板的琼脂上向外缘方向（离心方向）切一裂隙，一块平板切4条裂隙，每条裂隙长15 mm、宽3 mm，然后在裂隙中加入30～40μl酶粗提液，注意不能溢出。

3）35℃孵育18～24 h后阅读结果。

4）若在裂隙与头孢西丁纸片交界处出现矢状的细菌生长区域者，判为三维试验阳性，反之则为阴性。

除此之外，利用ESBLs和Amp C酶的活性可分别被不同的酶抑制剂所抑制的原理，将经典三维试验中的头孢西丁替换为头孢噻肟，将之与酶抑制剂克拉维酸和氯唑西林进行结合，可达到同时检测细菌产ESBLs和／或Amp C的目的。