（一）定义
纸片扩散法是将含有定量抗真菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂培养基表面，药物在琼脂中扩散，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。
E试验是指浓度梯度琼脂扩散试验，即浓度呈连续梯度的抗菌药物从塑料试条中向琼脂中扩散，在试条周围抑菌浓度范围内受试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。
（二）原理
（1）纸片法：将含有定量抗真菌药物的纸片，贴在已接种了测试菌的改良Shadomy琼脂表面上。纸片中的抗真菌药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。
（2）E试验：利用琼脂扩散法的原理，试纸条放于已接种菌液的改良Shadomy琼脂板上，从抑菌环与试纸条交界处可定量读出MIC值，并与该药物对测试菌的MIC呈负相关。
（三）适用范围
产孢丝状真菌（包括非皮肤癣菌），包括链格孢属、曲霉属、镰刀菌、拟青霉、根霉、波氏假阿什利霉、多育赛多孢等。
注：不适用于皮肤丝状真菌、双向真菌。
（四）操作步骤
（1）药敏平板制备：培养基推荐采用不补充钙、镁的MH葡萄糖琼脂（Mueller-Hinton Agar+2%葡萄糖+0.5μg／ml亚甲蓝，pH 7.2～7.4）。MH葡萄糖琼脂应保持潮湿，但琼脂表面和培养皿盖上不应有水滴。MH 葡萄糖琼脂药敏平板可于2～8℃环境中放置7 d，如果有塑料包装防止平板干燥，则可以放置时间更长一些。
（2）抗真菌药物：①棘白菌素类：卡泊芬净。②三唑类：伊曲康唑、伏立康唑，氟康唑，泊沙康唑。
（3）受试菌和接种菌液
1）受试菌要求：纯受试菌接种在土豆琼脂平板（PDA）上，大部分丝状真菌需要在（35±2）℃生长至产孢良好或者生长7 d。部分真菌48 h即可产生大量孢子，镰刀菌属需要在35℃培养48～72 h，然后在28～30℃培养至7 d。
2）接种菌液的制备和接种菌量：挑取单克隆菌落，重悬于5 ml 0.85%无菌生理盐水（添加吐温20有助于曲霉属调制菌液）中，静置3～5 min后取上清振荡15 s，使用1 cm 比色杯，测定530 nm 光密度的波长将菌液调成接种液备用，此时接种液浓度在（0.4～5）×106 CFU／ml。
A530值为0.09～0.13的菌株：曲霉属、皮炎外瓶霉（Exophiala dermatitides）、淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum，原名：淡紫拟青霉）、宛氏拟青霉（Paecilonyces variotii）、申克孢子丝菌（Sporothrix schenckii）。
A530值为0.15～0.17的菌株：斑替支孢瓶霉（Cladophialophora bantiana）、镰刀菌属（Fusarium）、奔马赭霉（Ochroconis gallopava）、根霉属（Rhizopus）、毛霉菌目（Mucorales）、尖端赛多孢菌（Lomentospora prolificans，又称scedosporium apiospermum）。
A530值为0.25～0.30的菌株：链格孢属（Alternaria）、离蠕孢属（Bipolaris）。(www.xing528.com)
也可以通过血细胞计数仪进行计数，较好的菌悬液浓度应该是0.2～2.5 CFU／ml。
（4）接种（菌液涂布）
1）手工：用无菌棉拭子在接种液中搅拌吸取菌液，然后在管壁上压紧棉拭子以去掉多余的接种液，将接种液迅速均匀地涂布于整个MH 补充琼脂表面，涂布3次，每次将培养皿旋转60°，最后用棉拭子将培养皿边缘涂布一圈。接种液必须在配置好后的15 min内接种。
2）放置药敏纸片前，将涂布好的平板半开盖倒置在工作台上3～5 min晾干。
（5）药敏纸片的放置
1）要求：每两张纸片的中心距离应＞24 mm。直径90 mm 的平皿可以贴不超过5个纸片，直径150 mm的平皿可以贴不超过12个纸片。由于药物会在琼脂表面立即扩散，所以一旦纸片贴在琼脂上，就不能移动了。
2）手工：用无菌镊子夹贴抗真菌药物的药敏纸片，每个纸片均用镊子压实，保证纸片与琼脂表面充分接触。
（6）孵育：培养到生长良好时，毛霉16～24 h；黄曲霉、黑曲霉、烟曲霉24 h，其他曲霉48 h；链格孢、离蠕孢、拟青霉、波氏假阿什利霉、多育赛多孢48～72 h。
（7）结果阅读和敏感性判定
1）手持培养皿于黑色背景上方，无反光的黑色背景，采用反射光观察。抑菌圈边缘应为真菌生长显著减少处（图5-6-1）。抑菌圈边缘不明显的生长和抑菌圈内的大菌落是经常遇到的，应忽略不计。如果将这些菌落转种并且进行检测，能够得到更确切的抑菌圈值（伊曲康唑MIC=0.5μg／ml，伏立康唑MIC=0.064μg／ml。见图5-6-2）。
2）质控菌株：宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii）ATCC MYA-3630，克柔念珠菌（Candida krusei）ATCC 6258。
图5-6-1 土曲霉纸片法药敏结果示意图
＃1（POS）泊沙康唑读取100%抑制处；＃3（CAS）卡泊芬净读取生长明显抑制处
图5-6-2 黄曲霉E试验药敏结果示意图
伊曲康唑（MIC=0.5μg／ml）和伏立康唑（MIC=0.064μg／ml）分别读取生长明显抑制处，判读需要100%抑制
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