化学纯化病毒步骤与原理详解

用化学方法对病毒进行纯化包括以下几个步骤：

1.病毒的释放与萃取。大多数病毒颗粒主要存在于寄主组织细胞内，因此提纯的第一步是设法破碎寄主感病的细胞，使病毒颗粒释放出来。常采用的方法有反复冻融法、电动搅拌法、超声波振荡法、研磨法等。

▲超声波振荡原理图

大多数病毒在pH=7.0左右时，性质最稳定、溶解度最大，此时可以用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH=7.0）来破碎感病细胞，萃取病毒，使病毒颗粒溶解在萃取液中。而有些二十面体结构的病毒，如BMV，其最大溶解点在pH=5.0左右，在此情况下则应当用0.1mol/L（pH=4.5）的乙酸缓冲液。

通常破碎细胞、萃取以及以后各提纯步骤都应在4℃左右进行操作，以保证各种酶的活性。

很多种毒粒容易聚集，从而使其变性，或由于较难再悬浮，很容易在低速离心机去残渣时被抛弃。因此，萃取液中常加些非离子型去垢剂，以达到防聚和解聚的作用。

2.病毒萃取液的分级纯化。

染病细胞破碎后，其萃取液是病毒颗粒与解体细胞的各种亚细胞器和碎片的复杂混合物。提纯病毒的技巧就在于如何巧妙地发现和利用病毒和寄主细胞的理化性质的区别，如大小、形状、密度、表面电荷等，把病毒分级纯化，并尽可能减少来自寄主细胞物质的污染。纯度从理论上讲是相对量，对纯度的要求取决于使用纯化病毒的目的。而纯化的目的则决定了纯化方法的设计。(www.xing528.com)

▲低速离心机

▲凝胶色谱仪

（1）清除较大的细胞器。

通常纯化的第一步是将萃取液中较大的细胞组分（如细胞核、线粒体，如果是植物还会有叶绿体和坚硬的细胞壁大碎片）通过5～15分钟的低速离心（1000～10000g）清除。剩下的上清液则含有小分子可溶性物质。此步骤应选择好萃取缓冲液，避免毒粒沉淀或聚集。

（2）去除寄主蛋白质。

低速离心后病毒萃取液的上清液中除含有病毒颗粒外，还有可溶性的小分子，如糖类、盐类和氨基酸等，以及大小介于迅速沉降物与可溶性小分子之间的多种大分子蛋白质和内质网小碎片等。正是这些中间型分子和亚细胞结构往往与病毒颗粒的大小、形状和组成成分很相似，又很稳定，于是成为病毒纯化过程中最棘手的问题。为有效地将病毒颗粒与寄主组分分开，实验中多利用两者在大小、形状、密度和分子表面物化性质上的差别而设计纯化方案。比较常用的方法有沉淀法、离心法、凝胶色谱法和电泳法等。