化学键合色谱法在仪器分析中的应用

以物理方法涂渍在惰性载体上的固定液容易流失，是其无法克服的缺陷，更不适合梯度洗脱的操作。为此，人们将各种不同的的有机官能团通过化学反应共价键键合到硅胶表面的游离羟基上，而生成化学键合固定相，进而发展成化学键合色谱法。

化学键合相对各种极性溶剂都有良好的化学稳定性和热稳定性。由它制备的色谱柱柱效高、使用寿命长、重现性好，几乎对各种类型的有机化合物都呈现良好的选择性，特别适用于具有宽范围容量因子的样品的分离，并可用于梯度洗脱。

根据键合固定相与流动相相对极性的强弱，可将键合相色谱法分为正相键合相色谱法和反相键合相色谱法。在正相键合相色谱法中，键合相的极性大于流动相的极性，适用于分离油溶性或水溶性的极性和强极性化合物。在反相键合相色谱法中，键合相的极性小于流动相的极性，适用于分离非极性、极性或离子型化合物，其应用范围比正相键合相色谱法更广泛。据统计，在高效液相色谱法中70%～80%的反相任务皆由反相键合相色谱法来完成的。

1.正相键合相色谱法

键合相的极性大于流动相的极性的色谱法，称为正相键合色谱法。它是将全多孔（或薄壳）微粒硅胶载体，经酸活化处理制成表面含有大量硅羟基的载体后，再与含有极性基团Y（如—NH2、—CN、—O—等）的硅烷化试剂反应，生成表面具有极性基团的键合相。

溶质在键合相上的分离机理属于分配色谱：

式中，A为硅胶表面基体（SiO—），R为键合的烷基部分，Y为键合相外端极性基团，M为溶剂分子，X为溶质分子。ARY·M为溶剂化的固定相，X·M为溶质溶解于流动相中的状态，ARY·X为溶质溶于键合相的状态。

在正相色谱柱中，溶质分子在两相中的分配系数由式（10-18）计算，它主要依靠范德华作用力的定向作用力、诱导作用力或氢键作用力的差别，而使其K或k不同而分离。

例如，用胺基键合相分离极性化合物时，主要依靠被分离组分（如糖类）与键合相的氢键作用力的强弱差别而分离。若分离含有芳环等可诱导极化的非极性样品，则键合相与组分分子的作用力，主要是诱导作用力。

在作正相洗脱时，流动相的极性增大，洗脱能力增加，k减小，tR减小；反之，k与tR都增大。分离结构相近的组分时，极性大的组分后出色谱柱。

2.反相键合相色谱法

键合相的极性小于流动相的极性的色谱法，称为反相键合相色谱法。它的固定相是将全多孔（或薄壳）微粒硅胶载体，经酸活化处理后与含烷基链（C4、C8、C18）或苯基的硅烷化试剂反应，生成表面具有烷基（或苯基）的非极性固定相。

反相键合色谱法的分离机理有属于分配色谱和属于吸附色谱法两种论点。

分配色谱的作用机制认为，假设在由水和有机溶剂组成的混合溶剂流动相中，极性弱的有机溶剂分子中的烷基官能团会被吸附在非极性固定相表面的烷基基团上，而溶质分子在流动相中被溶剂化，并与吸附在固定相表面上的弱极性溶剂分子进行置换，从而构成溶剂在固定相和流动相中的分配平衡。其机理和前述正相键合相色谱法相似。

吸附色谱的作用机制认为，溶质在固定相上的保留是疏溶剂作用的结果。当溶质分子进入进行流动相后，即占据流动相中效应的空间，而排挤一部分溶剂分子；当溶质分子被流动相推动与固定相接触时，溶质分子的非极性部分会将非极性固定相上附着的溶剂膜排挤开而构成单分子吸附层。这种疏溶剂的斥力作用是可逆的，当流动相极性减小时，这种溶剂斥力下降，会发生解缔，并将溶质分子释放而被洗脱下来。疏溶剂作用机制可用图10-5来描述。

图10-5　反相键合相表面上溶质分子与　烷基键合相之间的缔合作用

烷基键合相对每种溶质分子缔合作用和解缔作用能力之差，就决定了溶质分子在色谱过程的保留值。每种溶质分子的容量因子k与它的相比、缔合总自由能变量ΔG及温度相关，可表示为lnk=ln(Vs/Vm)-ΔG/RT。以下简述三个因素对溶质保留值的影响。

（1）溶质分子结构对保留值的影响

在反相键合相色谱法中，溶质的分离是以它们的疏水结构差异为依据的，溶质的极性越弱，疏水性越强，保留值越大。根据疏溶剂理论，溶质的保留值与其分子中非极性部分的总表面积有关，其与烷基键合固定相接触的面积越大，保留值则越大。

根据溶质分子中非极性骨架的差别，或衍生引入官能团的性质、数目、取代基位置的不同，可初步预测溶质的保留顺序。如，具有支链烷基化合物的保留值总比直链化合物的保留值小。例如，饱和四碳醇的洗脱顺序为叔丁醇、仲丁醇、异丁醇和正丁醇。

固定相：硅胶与C4、C10、C18烷基硅烷反应

又如，当苯酚分子中分别甲基、乙基、丙基时，其k值增大；若引入一个硝基，其k值增大，但若继续引入两个或三个硝基时，其k值明显减小。

（2）烷基键合相特性对保留值的影响

烷基键合固定相的作用在于提供非极性作用表面，因此键合到硅胶表面的烷基数量决定着溶质的k大小，烷基的疏水特性随碳链的加长而增加，溶质的保留值也随烷基碳链长度的增加而增大，如图10-6所示。(www.xing528.com)

图10-6　反相键合相碳链链长　对样品保留值的影响

固定相：硅胶与C4、C10、C8烷基硅烷反应

随着烷基碳链的增长，增加了键合相的非极性作用的表面积，其不仅影响溶质的保留值，还影响色谱柱的选择性，即随烷基碳链的加长其对溶质分离的选择性也增大。

（3）流动相性质对保留值影响

流动相的表面张力越大、介电常数越大，其极性越强，此时溶质分子与烷基键合相的缔合作用越强，流动相的洗脱强度越弱，导致溶质分子的保留值越大。

3.离子抑制色谱法

在反相键合相色谱中，一些弱酸、弱碱和两性化合物，由于有弱解离情况存在，分离效果并不好，峰拖尾严重，有时根本见不到色谱峰。为此，通过调节和控制流动相的pH，来抑制样品组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离这些弱解离化合物的目的，这种方法称为离子抑制色谱法（ISC）。

操作方法是向含水流动相中加入少量的弱酸、弱碱或缓冲盐为抑制剂，调节pH，抑制样品组分的解离，使组分分子保持中性分子状态，从而增加中性分子在固定相中的溶解度，增大保留值。

离子抑制色谱法适用的对象是解离平衡常数在3.0≤pKa≤7.0的弱酸、7.0≤pKa≤8.0的弱碱，以及两性样品。对于弱酸样品，抑制剂常用乙酸、甲酸等有机小分子酸；对于弱碱样品，抑制剂常用氨水等；对于两性样品，常用磷酸盐、乙酸盐等缓冲盐。对于pKa<3.0更强一些的酸、pKa>8.0更强一些的碱，应采用后面介绍的离子对色谱法或离子交换色谱法。

在离子抑制色谱法中，影响容量因子的元素，除了与反相色谱法有相同的影响因素外，主要还受流动相pH的影响。对于弱酸，当流动相的pH<pKa时，组分以分子形式为主，k与tR增大；pH>pKa时，组分以离子形式为主，k与tR减小。对于弱碱，情况相反。

在完成离子抑制色谱法实验后，应及时用不含弱酸、弱碱和缓冲盐的纯溶剂流动相冲洗色谱柱，使色谱流出曲线的基线保持平衡稳定达30min以上，以防仪器流路被腐蚀、堵塞、固定相被损坏等。

4.离子对色谱法

在反相键合相色谱法中，解离程度较强的弱酸、弱碱、两性盐等，它们主要以解离后的离子状态存在于流动相中，极性非常大，非极性键合固定相对它们几乎没有保留作用，所以不能进行有效分离。为了分离这些离子化强极性化合物，将“离子对萃取”原理引入高效液相色谱法中，提出了离子对色谱法（IPC）。

离子对色谱法是将一种与样品离子电荷（A+）相反的离子（B-），也称对离子、反离子，加入色谱系统的流动相中，使其与样品离子结合成弱极性的离子对（中性缔合物），从而增加样品离子（实际上是离子对）在非极性固定相中的溶解度，使分配系数增加，保留值增加，大大改善分离效果。

由于离子对不易在水中解离而迅速进入有机相中，存在下述萃取平衡：

式中，下标w、o表示水相和有机相。

此时样品离子A+会在水相和有机相中分布，其萃取系数为EAB为：

相对于被分离的少量的样品离子A+而言，加入的对离子B-是大量的，即使消耗了少量的B-，也可以认为对离子B-的量没有改变，是常数。若固定相为有机相，流动相为水溶液，就构成反相离子对色谱，此时A+的分配系数K和保留因子k分别为：

当流动相的pH、离子强度、有机改性剂的类型、浓度及温度保持恒定时，k与对离子的浓度[(B-)w]成正比。因此通过调节对离子的浓度，可改变被分离样品离子的保留时间tR。

在反相离子对色谱中，常用离子对试剂中，分离碱类采用磺酸盐为离子对试剂，如C5～C8的正构烷磺酸钠[CH3(CH2)5~8SO3Na，PIC-B5~8]、十二烷基磺酸钠[CH3(CH2)11SO3Na，SDS]等；分离酸类常用四丁基季铵盐（PIC-A），如四丁基胺磷酸盐等。除SDS外，其它离子对试剂一般价格较贵。