薄层色谱扫描法为您带来仪器分析中的实用技巧

利用薄层色谱扫描仪对薄层展开板上被分离组分进行光扫描可以获得薄层色谱扫描图，通过对薄层色谱扫描图的分析进行定性与定量分析的方法称为薄层色谱扫描法。

1.基本原理

用一束长宽可以调节的一定波长、一定强度的光辐射到薄层板上并对整个斑点进行扫描，通过测定斑点对光的吸收强度或所发出的荧光强度进行定量分析。薄层色谱扫描法一般分为薄层吸收扫描法和薄层荧光扫描法。

薄层吸收扫描法　薄层扫描测定斑点对光的吸收，通常采用透射法或反射法。但由于薄层板上的固定相是具有一定粒度的物质外加适量黏合剂构成的半透明固体，当光束辐射到薄层表面时，除透射光、反射光外，不可避免地存在散射光。从而导致薄层板上的组分斑点对光辐射的吸收度与组分浓度之间并不服从Lambert-Beer定律。但Kubelka-Munk理论充分阐明了薄层色谱斑点中组分吸光度与浓度的定量关系。根据Kubelka-Munk方程，当分离数SN≠0时，色谱斑点中组分的吸光度A与其浓度或量（KX）虽仍然存在严格关系，但不是一种直线关系（图8-10），为了方便定量，必须对曲线进行校直。目前的薄层色谱扫描仪均配有线性补偿器，根据Kubelka-Munk方程式，用电路系统将曲线校正为直线（图8-11），用于定量分析，也可采用计算机软件进行线性回归，求出回归方程，再进行定量分析。

图8-10　反射法Kubelka-Munk曲线（0<SX<20）

图8-11　线性校正

1—校正前的标准曲线；2—校正后的标准曲线

薄层荧光扫描法　利用薄层板上的组分斑点发出的荧光强度或荧光薄层板上暗斑的荧光猝灭程度，进行定量分析的方法称为薄层荧光扫描法。与分子荧光法相同，在点样量很小时，荧光强度与浓度呈线性关系（F=Kc）。定量分析时，扫描色谱峰的积分面积A相当于F，因此可直接用扫描峰面积A定量。

薄层荧光扫描法灵敏度比薄层吸收扫描法高1～3个数量级，最低检测限可达10～50pg，而且其专属性强，可避免一些杂质的干扰，基线稳定，定量线性范围宽。该法适合于组分本身能发射荧光或经过色谱前后衍生化产生荧光的化合物。

2.薄层色谱扫描仪

薄层色谱扫描仪由扫描主机、数据处理与信号输出系统等部分组成，主机部分与吸收光谱法类似，由光源、分光系统、薄层板放置仓、检测器等。数据处理与信号输出系统常包含在薄层色谱软件中，该软件不仅能对薄层色谱扫描仪进行操作控制，并进行数据分析与处理，而且某些高级软件系统能够对薄层色谱的其它仪器进行联机控制，如自动点样机、自动展开仪、薄层数码成像系统等，大大提升了薄层色谱的仪器化和自动化功能。(www.xing528.com)

3.扫描条件选择

薄层色谱扫描仪在光谱扫描方式上有单波长、双波长和连续波长扫描等方式，在光路设计上分为单光束扫描与双光束扫描等方式。双波长扫描的测定值由于扣除了斑点所在空白薄层的吸收值，薄层背景的不均匀性得到了补偿，扫描曲线基线平稳、测定精度得到改善。双波长扫描仪也有双波长单光束和双波长双光束两种类型。光扫描方式分为以下两种：

直线扫描　也称线性扫描，光以一定长度和宽度的光束照在薄层板的一端，薄层板相对于光束做等速直线移动至另一端。但外形不规则的斑点不适于此法。

曲线扫描　也称锯齿扫描，微小的正方形光束在斑点上进行锯齿状移动扫描。特别适合于形状不规则或浓度分布不均匀的斑点。

4.定量分析方法

薄层色谱扫描仪的基本功能是通过选择合适的测定参数对薄层斑点进行光谱扫描，获得薄层色谱扫描图。利用组分斑点的光谱扫描图，既可以进行定性分析与鉴别，又可以进行定量分析。其定量方式主要有以下三种：

外标法　定量分析时，在薄层板上定量点样品溶液时随行定量点上已知浓度的对照品溶液。展开后经薄层扫描，根据扫描峰面积和质量进行计算。外标法分为外标一点法、外标二点法和回归方程计算法。

内标法　在样品溶液中加入一种在样品中不存在的、性质与被测组分类似却又与被测组分很容易分离的标准物，即内标物。展开后经薄层色谱扫描，以被测组分斑点与内标物斑点薄层色谱扫描峰面积之比作为峰面积累计值进行定量计算。

归一化法　根据组分的含量与斑点得到薄层色谱扫描峰面积成正比，对于含有n个组分的混合物，若所有组分均被分离且扫描，则组分i的含量ωi为

采用该方法的条件是，被分析的各个组分在相对分子质量、吸收系数等性质上差别较小，组分斑点的面积均在线性范围内，样品中所有组分均被分离且被有些扫描。