薄层色谱法在仪器分析中的应用

将固定相均匀地涂敷在玻璃板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法称为薄层色谱法（TLC）。按照分离机理，TLC可分为吸附、分配和分子排阻色谱法等。按照效能，薄层色谱又可分为经典薄层色谱法和高效薄层色谱法。下面主要讨论吸附薄层色谱法。

1.固定相的选择

薄层色谱的固定相主要有硅胶、氧化铝、硅藻土及聚酰胺等吸附剂，硅胶最常用。薄层用硅胶粒度为10～40μm。硅胶中加入10%～15%的煅石膏后称为硅胶G。若在硅胶G中再加入荧光物质（如锰激活的硅酸锌）称为硅胶GF254，表示在254nm紫外光波长下呈强烈黄绿色荧光背景，适用于本身不发光又无适当显色剂显色的物质的检测。不含黏合剂的硅胶称为硅胶H。

硅胶有弱酸性，用于对酸性和中性物质的分离。若用一定pH的缓冲液，或加适当的碱性氧化铝制备薄板，或者在展开剂中加少量的酸或碱调成一定pH的展开剂，可改变硅胶的酸碱性质，适合各种物质分离的要求。

氧化铝比硅胶的吸附活性稍弱一些，一般薄层用氧化铝活性为Ⅱ～Ⅲ级，它有氧化铝H、氧化铝G、氧化铝HF254等。按照氧化铝的酸碱性，有碱性、酸性和中性氧化铝之分。碱性氧化铝适用于分离碳氢化合物、碱性化合物（如生物碱）和对碱性溶液比较稳定的中性物质；酸性氧化铝适合酸性成分的分离；中性氧化铝适用于醛、酮以及对酸碱不稳定的酯和内酯等化合物的分离。

铺板时常用黏合剂一般采用羧甲基纤维素钠CMC-Na。

对吸附剂固定相的选择方法，一般被分离物质极性强时应协助吸附能力弱的吸附剂；若被分离的物质极性弱，则应协助吸附能力强的吸附剂。

2.展开剂的选择

在吸附薄层色谱中，展开剂的选择主要根据被分离物质的极性、吸附剂的活性和展开剂的本性来决定。展开剂很少用单一溶剂的，一般采用二元、三元甚至多元溶剂。选择原则是根据被分离组分（溶解性、酸碱性、极性等）、固定相（活性、非活性）和展开剂（极性、非极性）三者之间的匹配关系来选择和优化，最终由实验结果确定。

实验中先用单一的低极性溶剂展开，然后再按照溶剂洗脱顺序依次更换极性较大的溶剂进行实验，用单一溶剂不能分离时，可用两种以上的多元展开剂，并不断地改变多元展开剂的组成和比例，因为每种溶剂在展开过程中都有其一定的作用：展开剂中比例较大的溶剂极性相对较小，起溶解物质和基本分离的作用，一般称为底剂；展开剂中比例较小的溶剂，极性较大，对被分离物质有较强的洗脱力，帮助化合物在薄层上移动，可以增大Rf值，但不能提高分辨率，可称其为极性调整剂；展开剂中加入少量的酸、碱，可抑制某些酸、碱性物质或其盐类的解离而产生斑点拖尾，故称之为拖尾抑制剂；展开剂中加入丙酮等中等极性溶剂，可促使不相混合物的溶剂混溶，并可以降低展开剂的黏度，加快展速等。

3.实验方法

制板　薄层板的薄层厚度和均匀性，对样品组分的分离效果和Rf的重复性影响很大。以硅胶、氧化铝为固定相的薄板，用于分离分析的薄层厚度一般以0.25mm为宜，用于分离制备的薄层厚度一般为0.5～0.75mm。先准备载板，然后进行薄层板铺制，方法有

（1）手工涂敷法：取一定量的吸附剂放入研钵中，加入3倍量的0.5%～0.8%的羧甲基纤维素钠水溶液，朝同一方向研磨成均匀的糊状物，然后涂铺在玻璃板上，以手工振动方法将载板反复振动，直到薄层表面平坦、均匀为止。将涂敷好的薄板至于水平操作台上晾干。

（2）机械涂敷法：商品薄层板涂铺器的种类和型号各不相同，使用方法按有关仪器的使用说明书操作即可。与手工涂敷法相比，机械涂敷法制成的薄层板更均匀，适合于定量分析。

最后将晾干的薄层板放入105℃的烘箱中活化0.5～1h，取出，置于干燥器中备用。

点样　点样方式有点状法和条状法。点状法更适合定性分析，条状法点样更适合微量制备分离。溶剂、点样量和点样方式是影响薄层色谱分离的重要因素。

制备样品溶液时，应避免用水，采用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等易挥发的有机溶剂，使点样后溶剂能迅速挥发，最好采用既容易挥发又与展开剂极性相似的溶剂。如果是水溶性样品，可用少量水溶解样品，再用甲醇或乙醇稀释定容的方法来制备样品溶液。

适当的点样量可使斑点集中；点样量过大容易引起拖尾或扩散；点样量太少又不容易检出。点样量还应视薄层的厚度、显色剂的灵敏度而定，一般是几微克至几十微克。用于制备的薄层色谱，点样量可达1mg以上。分离中药、天然产物时，点样量就需50μg以上。

点样管可用0.5～1mm的毛细管，定量分析的点样可采用平头微量注射器或自动点样器。点样位置一般设置离薄板下端1～1.5cm处，同时在点样的水平线两端边缘做好记号，作为展开剂和组分移行的起始位置。

用于分离分析的点样一般采用点状点样法，用于分离制备的点样可采用条状点样法。(www.xing528.com)

展开　将点好样的薄板置于层析缸中（图8-9），使点样端的下边缘与展开剂接触，这时展开剂带动样品组分向上移行，这个过程称为展开。

图8-9　立式双槽层析缸

层析缸有立式和卧式之分。立式层析缸有单槽和双槽的。展开槽应能够密闭，以使溶剂的蒸气压达到饱和状态，因为展开体系中溶剂蒸气压的饱和度对分离效果影响较大。在饱和情况下展开的时间要比不饱和时的时间短，分离效果好，且可消除边缘效应。边缘效应是指组分在薄层中展开后，薄板边缘的Rf值大于中部的Rf值的现象。

展开方式有如下一些可供选择。

（1）上行展开　在立式层析缸中进行。把已配制好的展开剂倒入层析缸中，注意溶剂深度不能超过0.5cm，将点好样的薄层板直立斜靠在层析缸中的一边，盖好盖子，展开剂会沿着薄层板向上移行展开。当展开距离适当时，取出薄层板，立即做好展开剂前沿位置的标记，等溶剂挥发干后检视。该方法是最常用的薄层色谱展开方式。

（2）近水平展开　在卧式层析缸中进行。将点好样的薄层板下端浸入展开剂约0.5cm，切记点样点不能没入展开剂中，把薄层板上端垫高使薄层板的水平角度为15°～30°，盖好盖子，展开剂在固定相的作用下，自下而上移行展开，该方法展开速度快。

（3）单向多次展开　取经展开一次的薄层板让溶剂挥发干，再用同一种展开剂，按同样的展开方式进行第二次、第三次展开，以便达到更好的分离效果。

（4）单向多级展开　取经展开一次的薄层板让溶剂挥发干，再改用另一种展开剂，按同样的展开方式进行第二次，依此类推进行的多重展开，以便达到更好的分离效果。

（5）双向展开　将第一次展开后的薄层板取出，挥去溶剂，再把薄层板旋转90°后，改用另一种展开剂展开。采用双向展开方式时，薄层板最好是方形的。

检识　展开完毕后，取出薄层板时立即对展开剂前沿做好标记，测量移行距离L0，然后再对组分斑点的移行距离Li进行定位。对有色组分斑点定位，可直接测量；对于无色组分斑点定位，则采用物理检出法和化学检出法。

（1）物理检出法：在紫外灯下观察薄层板上有无荧光斑点或暗斑（荧光猝灭斑点），常用波长有254nm和365nm，可根据待测组分的光谱性质选择使用。

（2）化学检出法：该法是利用化学试剂（显色剂）与待测物质反应，使组分斑点产生颜色而定位。显色剂可分为通用型和专属型两类显色剂。

通用型显色剂有碘、硫酸乙醇溶液等。碘对许多有机化合物都可显色，如生物碱、氨基酸、肽类、脂类、皂苷等，最大特点是显色反应往往是可逆的，在空气中放置时，碘升华后组分又回到原来的状态，便于进一步处理。10%的硫酸乙醇溶液可使大多数无色化合物显色，形成斑点，如红色、棕色、紫色等，还可在紫外灯下观察不同颜色的荧光。

专属型显色剂是对某个或某一类化合物显色的试剂。例如，三氯化铁的高氯酸溶液可显色吲哚类生物碱；茚三酮则是氨基酸和脂肪族伯胺的专用显色剂；0.05%荧光黄的甲醇溶液是芳香族与杂环化合物的专用显色剂；溴甲酚氯可使羧酸类物质显色，等等。

4.高效薄层色谱法简介

高效薄层色谱法（HPTLC）是在经典薄层色谱法基础上发展起来的更为精细、灵敏的薄层技术。高效薄层板一般为商品预制板，其最大特点是固定相颗粒细小而均匀，采用喷雾法制备而成，所以具有效率高、灵敏度高、展开时间短等优点。常用的高效薄层板有硅胶、氧化铝、纤维素和化学键合相薄层板。HPTLC与TLC有关参数比较，参见表8-6。

表8-6TLC与HPTLC有关参数比较