在上述已经达到平衡状态的色谱管顶端，加入样品溶液（量少为佳，不能超载），然后以一定液滴速度的流速冲洗色谱柱，根据样品各组分在色谱柱的分离情况：如果有颜色，就可看见谱带依次流出，用玻璃容器依次分别承接，就得到不同颜色的纯组分馏分；如果没有颜色或颜色区别不明显，可以采取馏分体积的方法依次承接，然后对各承接的馏分检验（如TLC），以指导承接馏分体积是否合适。
由于是手工操作，对于承接馏分体积不好把握。实验中可以采取以下方法确定。
（1）确定色谱柱的固定相体积Vb和流动相体积Vm。
取一根有刻度的玻璃色谱管，然后将溶剂注入色谱柱中，并把液面调至柱管约3/4处，读出溶剂体积为V1（mL），然后将一定量的固定相分次少量地从柱管口小心加入，边加入边调节放出溶剂，使液面始终处于原来的位置，这样反复进行直至固定相加完为止，最后量取放出溶剂的体积为V2（mL），那么色谱柱中固定相的总体积Vb（又称色谱床体积）就是排除流动相的体积，即Vb=V2，色谱柱中流动相的体积则为Vm=V1-V2。(www.xing528.com)
（2）确定流动相冲洗流速和盛接馏分体积。
根据色谱床体积，可以针对性地控制流动相流速，一般以每小时流出色谱柱的溶剂体积是色谱床的多少倍来计算，可以换算为每分钟流出多少滴，这样在实验中就观测和操作。例如，色谱床Vb=100.0mL，如果流动相流速为每小时1.8倍色谱床体积（即180mL/h），每滴溶剂体积约为0.05mL，换算为每滴流速为60滴/min。
有了色谱柱中流动相体积，即可知需要多少体积溶剂才可把色谱柱完全冲洗一次，这样就有目的地冲洗。进样后冲洗出来的第一个流动相体积Vm是空白的，应剔除，之后才可能有分离组分逐步流出，当成馏分体积。馏分体积在经典液相色谱的梯度洗脱中常有应用。
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