荧光分析技术在仪器分析中的新进展

1.时间分辨荧光分析

分子在激发和跃迁回到基态之间需要延缓一小段时间，由于分子组成和结构而具有不同的荧光寿命，据此进行分别检测，这就是时间分辨荧光分析。该法在测定混合物中某一组分的选择性比用化学法处理样品时更好，可免去前处理的麻烦。目前，时间分辨荧光分析已应用于免疫分析，形成时间分辨荧光免疫分析法。

2.同步荧光分析

在荧光物质的激发光谱和荧光光谱中选择一适宜的波长差值，常选Δλ=，同时扫描荧光发射波长和激发波长，得到同步荧光光谱，这就是同步荧光分析。荧光物质浓度与同步荧光光谱的信号峰高呈线性关系，据此进行定量分析。同步荧光光谱的信号Fsp(λem,λex)与荧光物质浓度c、激发光信号Fex及荧光光谱信号Fem间的关系为

式中，K为常数。同步荧光测定法具有使光谱简单、光谱窄化、减少光谱重叠、减少散射光影响、提高选择性等优点。

3.胶束增敏荧光分析

胶束溶液就是一定浓度的表面活性剂溶液。在表面活性剂分子结构中，都具有一个极性的亲水基和一个非极性的疏水基。在极性溶液中，几十个表面活性剂分子聚合成团，将非极性的疏水基尾部靠在一起，形成亲水基向外、疏水基向内的胶束。

溶液中胶束数量开始明显增加时的浓度称为临界胶束浓度。低于临界胶束浓度时，溶液中的表面活性剂分子基本上以非缔合形式存在。超过临界胶束浓度后，再增加表面活性剂的量，非缔合分子浓度增加很慢，而胶束数量的增加和表面活性剂浓度的增长基本上成正比。

极性较小而难溶于水的荧光物质在胶束溶液中溶解度会显著增加。例如，在室温下芘在水中溶解度在8.5×10-7mol·L-1以下，而在十二烷基磺酸钠的胶束水溶液中，芘的溶解度增加为4.3×10-2mol·L-1。胶束溶液对荧光物质的增溶作用是非极性的有机物与胶束的非极性尾部有亲和作用，使荧光分子定位于胶束的亲脂性内核中，对荧光分子起了一定的保护作用，减弱了荧光质点之间的碰撞，减少了分子的无辐射跃迁，增加了荧光效率，从而增加了荧光强度。这就是胶束溶液对荧光的增敏作用。

除此之外，胶束溶液提供了一种激发单线态的保护环境。荧光物质被分散和定域于胶束中，得到了有效的屏蔽，降低了溶剂在可能存在的荧光熄灭剂的熄灭作用，也降低了荧光物质因自身浓度太大造成的荧光自熄灭，从而使荧光寿命延长。这是胶束溶液对荧光的增稳作用。由于胶束溶液对荧光物质有增溶、增稳和增敏作用，可大大提高荧光分析法的灵敏度和稳定性。

4.三维荧光光谱测定法(www.xing528.com)

常见的荧光光谱是二维光谱，即荧光强度是随波长（激发波长或发射波长）的变化而描绘的曲线。如果同时考虑激发波长和发射波长对荧光强度的影响，则荧光强度应是激发波长和发射波长两个量的函数。描述荧光强度同时随激发波长和发射波长变化的关系图谱，称为三维荧光光谱。

三维荧光光谱可用两种图形方式表示：一是等角三维投影图，这种表示法比较直观，用三维坐标x、y、z分别表示方式波长、激发波长和荧光强度；二是等高线光谱图，以平面坐标的横坐标表示方式波长，纵坐标表示激发波长，平面上的点表示由两波长所决定的样品的荧光强度，将荧光强度相等的各点连接起来，便在λem-λex构成的平面上显示出一系列等强度线组成的等高光谱图。三维荧光光谱图可清楚表现出激发波长和方式波长变化时荧光强度的变化信息，提供了更加完整的荧光光谱信息。作为一种指纹图谱鉴定技术，进一步扩展了荧光光谱法的应用范围；作为一种快速检测技术，对化学反应的多组分动力学研究也有独特的优点；采用三维光谱技术进行多组分混合物的定性、定量分析，是分析化学的热点之一。

5.荧光免疫检测

免疫学的重要对象是抗原和抗体的反应问题。免疫检测法通常以未标记的抗原与特定抗体间的竞争性抑制作用为基础的。检测时，抗体和已标记的抗原两者组成混合物，两者浓度固定，且抗体的浓度受到限制以保证抗原处于过量。未标记的抗原加入一个在一定温度下培育过的混合物中，已标记的抗原被稀释，并发生竞争抑制作用而建立以下的平衡：

由于竞争作用，未标记的抗原使原来可连接于已标记抗原的抗体现场量减少了，因而减少了标记抗原-抗体络合物（AgL—Ab）的形成，从（AgL—Ab）络合物的减少或游离标记抗原AgL的增加，都可以检测试样中的抗原。荧光免疫检测采用荧光标记物（L）标记抗原，以进行测定。因此荧光标记物（荧光探针）的选择成为方法的关键所在。现在已有各种各样的荧光标记探针应用于生物、生化和医学临床检测。

6.磷光分析

早期的磷光测定是将样品溶于乙醚等非极性溶剂中，并置于低温液氮中，使其冷冻至玻璃状后进行测定，这样可以减少质点间的热运动碰撞概率，大大降低无辐射跃迁，得到稳定的磷光强度。现在可采用一定措施，如制备固体样品法和胶束法，可在室温下进行磷光分析。

7.联用技术

将荧光检测技术与其它仪器联用的研究，现在十分活跃，出现了流动注射荧光分析技术，液相色谱、薄层色谱、离子色谱等与荧光分析的联用技术，以及各荧光技术之间的联用。这些方法具有比一般荧光分析更高的灵敏度和选择性、分析速度快等优点，为药物分析的发展开辟了新的途径。