荧光仪器简介仪器分析

1.荧光计的主要部件

现代精密的荧光分光光度计，其主要部件包括激发光源、单色器、样品池、检测器和数据处理与显示等部件，如图3-9所示。早期的光电荧光计是以滤光片承担单色器的作用，已经淘汰，下面主要介绍荧光分光光度计。

图3-9　荧光分光光度计结构示意图

激发光源　要使荧光物质的荧光效率达到需要的值，必须使用比紫外-可见分光光度法更强的激发光源。目前荧光分光光度计通常使用氙灯作为激发光源。氙灯在30kV电压触发下，产生较强的连续光谱，分布在250～700nm范围内，而在300～400nm波段内射线的强度几乎相等。此外，也可以用石英灯泡封制的氘灯（220～450nm）或卤钨灯（300～700nm）。

单色器　单色器是由一组光学元件构成的组件，有棱镜型和光栅型两种。荧光分光光度计一般使用光栅型单色器。它有两个单色器，一个是激发单色器，介于光源和吸收池之间，称为第一单色器；另一个是发射单色器，处于激发光垂直的方向上，称为第二单色器。

吸收池　荧光分光光度计使用的吸收池一般是石英玻璃做成的，与紫外-可见分光光度计的吸收池两个毛面、两个透光面不同，它的四面全都是透光面。测低温荧光或磷光时，在石英吸收池之外套上一个装盛液氮的透明石英真空瓶，以降低温度。

检测器　用紫外-可见光作为激发光源时，产生的荧光多数在可见光范围内，用肉眼都可以观察到。荧光强度较低，用光电倍增管检测，其输出可用高灵敏度的微电计测定，或再经放大后输入记录器，自动绘制光谱图。

2.荧光计的使用技术

（1）荧光计的使用方法(www.xing528.com)

荧光分光光度计采用氙灯作为激发光源，通过第一单色器获得需要的激发光，然后照射到样品吸收池的溶液中，使荧光物质产生荧光，经过第二单色器获得发射光，再经检测器检测、放大器放大、记录与显示。

操作时，将发射单色器固定在比激发波长较长的任意波长上，以激发单色器进行波长扫描，记录不同激发波长下相应的荧光强度，即得到该物质的激发光谱，强度最大的激发波长就是该物质发射荧光最强的波长，也就是激发荧光最灵敏的波长。如果选择激发波长不是发射荧光最强的波长，仍可得到相同的荧光光谱，但荧光强度相应减弱一些。不同的荧光物质，其激发光谱是不相同的，发射的荧光波长也各异。

物质发射的荧光经发射单色器得到荧光光谱。测定方法是将激发波长固定在发射荧光最强波长处，将样品产生的荧光通过发射单色器，将此单色器放在波长稍长于激发光谱范围内扫描，即得到荧光强度F与荧光波长λ的荧光光谱，最高峰波长就是物质在最大激发波长下所产生的荧光最强波长。荧光物质的最大激发波长和所发射的最强荧光波长是鉴定物质的依据，也是定量测定时最灵敏的条件。

荧光分光光度计的入射狭缝及出射狭缝，用以控制通过波长的谱带宽度及照射到样品溶液中的光能强度。测定目的不同，可选择不同的狭缝宽度，以获得较好测定结果为最佳选择。

（2）荧光计的校正

灵敏度的校正　荧光计的灵敏度可用被测出的最低信号来表示；或用某一标准荧光物质的稀溶液在一定激发波长照射下，能反射出最低信噪比时的荧光物质的最低浓度来表示。影响灵敏度的因素很多，大致与以下三方面情况有关：第一与仪器上的光源强度、单色器的性能、放大系统的特征和光电倍增管的灵敏性有关；第二与所选用的波长和狭缝有关；第三与被测的空白溶剂的拉曼散射、杂质荧光有关。在每次测定时，在选定波长及狭缝宽度的条件下，先用一种稳定的荧光物质配成浓度一致的标准溶液进行校正（或称标定），使每次所测得的荧光强度调节至相同数值（50%或100%）。如果被测物质本身所产生的荧光很稳定，自身就可作为标准液。常用的标准荧光溶液有酚的甲醇溶液、吲哚的乙醇溶液、奎宁的硫酸溶液及荧光素的水或乙醇溶液，尤其以奎宁的硫酸溶液产生的荧光最稳定。奎宁标准荧光溶液的配制：用1.0mg的奎宁标准品溶于1 000mL硫酸溶液（硫酸浓度0.05mol/L）中，制成含奎宁浓度为1.0μg/mL的母液，仪器校正时取母液进行不同倍数的稀释即可测定。

波长的校正　荧光计的波长刻度在出厂前经过校正。但若仪器的光学系统和检测器有所变动，或在使用较长时间之后，或在重要部位更换之后，有必要用汞灯的标准谱线对单色器的刻度重新校正，特别是在精细的鉴定工作中尤为重要。

激发光谱和发射光谱的校正　用荧光分光光度计所测得的激发光谱或荧光光谱，一般是表观的，是不真实的。原因很多，如单色器的波长刻度不够准确，拉曼散射光的影响以及狭缝宽度较大等。这些因素就需要消除。最主要的是光源的强度随波长而变，及每一个检测器（如光电倍增管）对不同波长的接受敏感度不同，即检测器的感应与波长不呈线性关系。因此，在用单光束荧光分光光度计测定激发或发射光谱时，若不用参比溶液做相对校正，会产生较大的系统误差。尤其是当峰的波长处在检测器灵敏度曲线的陡坡时，误差最显著。因此，先将每一波长的光源的强度调整到一致（仪器上附有的校正设备），然后根据表观光谱上每一波长的强度除以检测器对每一波长的感应强度数值进行校正，以消除这种误差。各商品仪器的校正方法不完全相同，这里不赘述了。目前精密的荧光分光光度计大多采用双光束光路，用参比光束可抵消光学误差。