聚丙酰胺凝胶电泳简称为PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，其聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（APS）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值与凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带的清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。两种孔径的凝胶、两种缓冲体系、三种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
蛋白质免疫印迹法可应用于：（1）从蛋白质混合物中检出目标蛋白质；（2）定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；（3）用于蛋白质—蛋白质、蛋白质—DNA、蛋白质—RNA相互作用后续分离。
【实验原理】
蛋白质免疫印迹法（Western Blotting），是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测；对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blotting采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
【实验材料】
蛋白质样品。
【试剂、试剂盒】
丙烯酰胺 SDS Tris-HCl β-巯基乙醇，甘氨酸，Tris，甲醇，PBS，NaCl，KCl，Na2 HPO4，KH2PO4，考马斯亮蓝，乙酸，脱脂奶粉，硫酸镍胺，H2O2，DAB试剂盒。
【试剂准备】
1.SDS-PAGE试剂配制：30%聚丙烯酰胺贮液，丙烯酰胺150g，甲叉双丙烯酰胺4g，双蒸水500mL，滤纸过滤后，棕色瓶避光4℃保存；
1.5mol/L，pH8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：18.15g Tris，用1mol/L HCl定容至100mL，棕色瓶避光4℃保存；
1.0mol/L，pH6.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：12g Tris，用1mol/L调pH至100mL，棕色瓶避光4℃保存；
10%SDS溶液：10g SDS加水定容至100mL，完全溶解室温保存；
10%AP溶液：0.1g AP（过硫酸铵）加水定容至1mL，用前新鲜配制；
1×SDS-PAGE电泳缓冲液：25mLTris（3.0285g/L），192mL甘氨酸（14.41g/L），0.1%SDS（1g/L），pH 8.30；
染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250溶解于45mL甲醇，45mL水，10mL冰醋酸，过滤除去杂质；
脱色液：45mL甲醇，45mL水，10mL冰醋酸；
固定液：50mL甲醇，40mL水，10mL冰醋酸；
2×SDS-PAGE上样缓冲液：10%SDS 0.4mL，0.375mL Tris-HCl（pH6.8）0.333mL，甘油0.2mL，1% 溴酚兰10μL，β-疏基乙醇100μL，加水定容至1mL，分装后-20℃保存。
2.匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl（pH 6.8）1.0mL，10%SDS 6.0mL，β-巯基乙醇0.2mL，ddH2O 2.8mL。
3.转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，甲醇200mL，加ddH2O定容至1000mL。(www.xing528.com)
4.0.01M PBS（pH7.4）：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，加ddH2O至1000mL。
5.膜染色液：考马斯亮蓝0.2g，甲醇80mL，乙酸2mL，ddH2O118 mL。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g溶于20mL的0.01M PBS中。
6.显色液：DAB 6.0mg，0.01M PBS 10.0mL，硫酸镍胺 0.1mL，H2O21.0μl。
【操作步骤】
1.蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5～1min。然后在4℃的温度下，13000g离心15min。取上清液作为样品。
2.电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3.转移：（半干式转移）
（1）电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。
（2）膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。
（3）转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源，恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果做对比。
4.免疫反应
（1）用0.01M PBS洗膜，5min×3次。
（2）加入包被液，平稳摇动，室温2h。
（3）弃包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。
（4）加入一抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃放置12h以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。
（5）弃一抗和1%BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min×4次。
（6）加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释），平稳摇动，室温2h。
（7）弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。
（8）加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
【注意事项】
（1）一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。
（2）显色液必须新鲜配制使用，最后加入H2O2。
（3）DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。
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