蛋白质定量检测原理-从《生命科学基础研究入门》获得

蛋白质的定量分析对蛋白质的分离、纯化、结构和功能研究十分必要，同时，也是临床检验、食品工业和营养卫生等方面常涉及的分析方法。

（一）凯氏定氮法

凯氏定氮法于1833年由丹麦化学家凯道尔建立，后来经过了改良使其更符合蛋白质定量的要求。此方法的理论基础是蛋白质中的含氮量通常占其总重量的16%左右（12%～19%），因此，通过测定物质中的含氮量便可估算出物质中的总蛋白质含量（假设测定物质中的氮全来自蛋白质），即蛋白质含量=含氮量/16%　=6.25×含氮量。

蛋白质样品用浓硫酸消化后，可以转变成硫酸铵，硫酸铵中的NH4+与NaOH反应又可转变成NH3，用硼酸液吸收后，可由标准盐酸滴定并定量。此方法测定范围为0.2～1.0mg氮。

（二）双缩脲法

蛋白质含有两个以上的肽键，故有双缩脲反应，此法也因此得名。在强碱条件下，肽键的质子被解离，二价铜离子和失去质子的多链中的氮原子相结合产生稳定的紫色络合物，在540～560nm处测定其光吸收值，此值与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。显色反应仅与肽键数呈正比关系，与蛋白质的分子质量及氨基酸组成无明显关系。二价铜离子与除精氨酸以外的所有氨基酸和二肽均不发生反应，仅和1-亚氨基缩脲、2-亚氨基缩脲、丙二酰胺等少数几种物质有颜色反应，所以基本上可以认为这是蛋白质特有的反应。

（三）Folin-酚试剂法（Lowry法）

此方法由Lowry于1951年建立，是目前应用最多、最广、研究最深入的蛋白质含量测足方法。本法是双缩脲反应的发展，它结合了双缩脲法中铜盐反应和Folin试剂反应的特点。试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂乙在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应。所以，此法是通过肽链或极性侧链的铜络合物的较慢反应以及芳香族氨基酸残基（如酪氨酸和色氨酸）的迅速反应，把磷钼酸、磷钨酸发色团还原为暗蓝色（磷钼蓝），且颜色深浅和蛋白质含量在一定范围内呈线性关系。该法的优点是比双缩脲法反应灵敏性提高了许多倍，但对酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，测定的误差大，这是由它的原理所决定的。另外，该法较费时，标准曲线的线性也不太好。(www.xing528.com)

（四）紫外分光光度法

由于蛋白质中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸残基中的苯环含有共轭双键，蛋白质溶液在275～280nm处有一紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质的OD280与其浓度成正比，据此，可进行蛋白质定量测定。

（五）考马斯亮蓝G-250染色法

考马斯亮蓝G-250染色法于1976年由Bradform建立。考马斯亮蓝G-250具有红色和蓝色两种色调，在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色，它与蛋白质通过疏水作用结合后，变为蓝色。色素对可见光谱的最大吸收值从465nm处转移到595nm处。蛋白质和色素的结合反应很快速，约在2分钟的时间内达到平衡，在室温1小时之内是稳定的。在0.01～1.0mg蛋白质/mL范围内，蛋白质含量与OD595值呈正比。

（六）BCA法

BCA（bicinchoninic acid）是对一价铜离子敏感、稳定和高特异活性的试剂。在碱性溶液中，蛋白质将二价铜（Cu2+）还原成一价铜（Cu+），后者与测定试剂中BCA形成一个在562nm处具有最大光吸收的紫色复合物。复合物的光吸收强度与蛋白质浓度呈正比。