离子交换层析：蛋白质分离方法

（一）基本原理

蛋白质分子是带电的大分子，其带电状态在不同液相环境中会发生变化。根据蛋白质分子带电状态的不同，在一定的pH条件下，用离子交换层析可实现对蛋白质的分离。通常使用各种离子交换剂作为层析填料。通过化学反应将带电基团引入到惰性支持物上而形成离子交换剂，根据带电基团所带电荷的不同分别称为阴离子交换剂和阳离子交换剂。通过静电结合在离子交换剂上的离子称为平衡离子。在适当的条件下，包括蛋白质在内的可溶于水的离子型生物大分子，可结合到交换剂上，从而通过离子交换层析可以提纯所需的大分子化合物。

离子交换层析所用的介质是一类在基架上固定有离子化基团的凝胶，不同的蛋白与这些基团的结合能力不同，因此，用不同浓度的反离子溶液洗脱时，其洗脱速度也不同，从而实现不同蛋白质的分离。影响离子交换层析分离能力的因素主要有pH、交换基团类型、盐浓度、上样量、柱的塔板数、洗脱梯度和流速等。

离子交换主要有四个步骤：①离子向交换剂颗粒表面扩散。均一溶液中这个过程进行得很快。②离子在交换剂颗粒内部向其带电部分扩散，扩散速度取决于交联剂的交联度和溶液的浓度。这一过程是离子交换过程中的限速步骤。③离子在交换剂带电部分的交换。这一步可以很快发生平衡。被交换离子所带的电荷密度越大，与交换剂结合越牢，也就越难被其他离子替换下来。④洗脱液流过交换剂表面时，扩散至交换剂表面的被交换离子扩散至周围溶液中。

蛋白质在高于其等电点的溶液中带负电，可被阴离子交换剂吸附，反之，则可被阳离子交换剂吸附，所以pH的选择和交换基团的选择相互关联。但是，蛋白质般只能在一定的pH范围内稳定，超出此范围则会影响蛋白质的活性。若蛋白质在pH高于和低于其等电点的溶液中都能保持稳定，应根据分离能力选择pH和交换基团的类型。为了利于被介质吸附，要求样品含盐浓度低。如果样品含盐浓度较高，需先经过透析、稀释或凝胶脱盐等处理，然后再进行离子交换层析分离。离子交换层析上的样量取决于介质的载量。特定条件下的载量和分离效果须经试验确定。介质的直径、柱长和装填均匀度决定了柱的塔板数。通过减缓洗脱梯度，降低流速，也能提高分离效果。

层析中所用的离子交换剂主要有四种类型，即离子交换纤维素、交联葡聚糖离子交换剂、交联琼脂糖离子交换剂和离子交换树脂。前三种是目前较为常用的类型。

（二）材　料

（1）仪器设备：快速蛋白液相层析系统（FPLC）。

（2）层析介质：DEAE-Sepharose。

（3）试剂：溶液A，PBS（pH 8.0）；溶液B，PBS（pH 8.0）+2mol/L NaCl。

（三）步　骤(www.xing528.com)

（1）用5倍柱体积的溶液A以300cm/h的线性流速平衡层析柱。

（2）以300cm/h的线性速度将已脱盐的样品泵入层析填料。

（3）以盐离子渐进梯度洗脱法洗脱。在10倍于柱体积的洗脱液中，溶液B的含量从0逐渐上升至100%，而溶液A的含量从100%逐渐下降至0，分别收集不同离子强度下的洗脱液，并测定其在280nm波长下的OD值。根据分辨率决定洗脱液的流速。一般而言，流速越慢，分辨率越好。

（4）用SDS-PAGE判断分离样品的分子质量和纯度，以相应的蛋白活性检验方法和抗原检验方法判断样品中目标蛋白质的含量。

（5）10倍柱体积的10%的溶液B洗脱留在柱上的杂蛋白。

（四）注意事项

（1）缓冲液的选择。对阴离子交换剂应当用阳离子缓冲液，而对阳离子交换剂则应用阴离子缓冲液。只有缓冲液的离子电荷与离子交换剂相反，它才能参与离子交换过程，降低离子交换剂的缓冲容量，从而引起pH的变化。因此，所选择的pH必须使要分离的离子所带的电荷与离子交换剂的平衡离子所带的电荷种类相同。为保持较高的缓冲容量，缓冲液离子的pK要与所需的pH接近（土0.7）。所选择的缓冲系统不能影响被分离的蛋白质的活性溶解度，并且不能干扰对其进行监测分析。

（2）层析柱的准备。层析柱的大小取决于所用介质的结合容量。柱的形状通常以直径与高度之比为1∶15为宜。最常用的直径是1cm、2cm、2.5cm，如果要增加离子交换剂体积时，必须增加柱直径。柱的长度不应短于20cm，增加柱长能增加分辨率，当洗脱过程中梯度变化剧烈时，不能用过长的柱，以避免区带扩散较宽而降低分辨率。成分复杂的样品，宜选用更大的柱子。处理好的交换剂装柱的好坏对层析的效果影响很大，装柱时交换剂在柱中分布均匀，不能有节和气泡存在，沉积表面要平整。

（3）加样量。实验的目的、样品中目标蛋白质的浓度及对交换剂的亲和力决定了上样量的多少。若目标蛋白含量低，与交换剂亲和力大，可将数倍于柱床体积的样品通过柱，至该成分他和为止，以浓缩富集。若提高分辨率时，加样时紧密吸附的区带不应超过柱床体积的10%。

（4）洗脱加样后的洗脱过程就是用足量的起始缓冲液充分洗涤柱床，以去除未吸附的组分。洗脱的具体方法主要有两种，即pH梯度洗脱和离子强度梯度洗脱。前者是通过改变缓冲液的pH，使蛋白质分子所带的电荷减少，从吸附的介质上解离下来（为保持蛋白质的活性，通常不采用这种洗脱方法）。后者是通过改变缓冲液的离子强度，将蛋白质分子从介质上替换下来，由于这种方法能够较好地保持蛋白质的活性，因此，在实践中较为常用。如果对所要分离的组分在离子交换剂上的层析情况十分清楚，则分离更能有的放矢。一般情况下，最好先进行线性梯度试验，再根据线性梯度的结果选择合适的阶段洗脱梯度。此外，采用离子强度梯度洗脱时在洗脱缓冲液中加入适当的KCl、NaCl等非缓冲盐类，还能在不提高缓冲离子浓度的情况下增加洗脱能力。