亲和层析：快速提纯蛋白质的方法

（一）基本原理

亲和层析是利用配基配体之间的特异性吸附，即利用生物大分子的生物学特异性而设计的层析技术。如抗原和抗体、底物和酶以及DNA和DNA结合蛋白质间特殊的亲和力，在条件适宜时它们能牢固地结合成复合物。利用这种特性将复合物中的配基或配体固定在不溶的载体上，以特异性分离提纯所需的大分子物质。一般的蛋白提纯方法操作步骤复杂，而亲和层析一步就可以提纯数百倍甚至数千倍，产品得率可高达70%～95%。与其他提纯方法相比，亲和层析还具有分离速度快的优点。因此，对含量少且不稳定的蛋白质，亲和层析是较好的提纯方法。用亲和层析可以迅速将能破坏蛋白结构的蛋白水解酶从污染物中去除，可以最大量地保存所需的蛋白质。亲和层析的简要过程如下：首先将支持物一配体络合物以适当的缓冲液装在柱中。然后将蛋白粗提物加到柱顶，当溶液通过层析柱时，可与配体结合的蛋白被固定在柱上，而大多数杂质则径直通过。等不需要的杂质除去后，再用适当的方法将吸附在柱上的蛋白洗脱下来。

（二）材　料

（1）层析介质抗体。（Ab）-Sepharose和活化后被淬灭的Sepharonse（对照）。两者不同的是后者不加抗体或耦联了无关抗体。

（2）试剂。细胞或组织匀浆 ，Tris盐/叠氮盐（TSA）溶液（冰冷），裂解缓冲液（冰冷），5%（W/V）脱氧胆酸钠（过滤除菌，室温保存），磷酸盐洗涤缓冲液（pH 7.3），pH8.0和pH9.0的Tris缓冲液（冰冷），三乙醇胺缓冲液（冰冷），1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 6.7，冰冷），层析柱保存缓冲液（冰冷）、层析柱、离心管（Beckman）。以上试剂的配制均须在4℃或冰上进行。

（三）步　骤

（1）将一支被淬灭的 Sepharose预柱（5mL柱床）和一支 Ab-Sepharose（5mL，5mg/mL抗体）免疫亲和层析柱连接起来。

（2）冰冷的TSA溶液将细胞重悬至（1～5）x 108个/mL，也可向收集的细胞或组织匀浆中加入1～5倍的TSA。然后加入相同体积的冰冷裂解缓冲液，在4℃温度下搅拌1小时。

（3）4000g离心10分钟，以除去细胞核，保留上清液。

（4）若提纯膜抗原，可在去核上清液中加入0.2体积的5%脱氧胆酸钠溶液，冰浴或4℃下放置10分钟，然后转移至离心管中，100 000g下离心1小时，小心移出上清液，保留备用。

（5）预柱连于免疫亲和层析柱，并将其他装置组装起来。

（6）依次用下列缓冲液洗柱：

①10倍柱床的磷酸盐洗涤缓冲液（pH 7.3）。

②5倍柱床的Tris缓冲液（pH 8.0）。

③5倍柱床的Tris缓冲液（pH9.0）。

④倍柱床的磷酸盐洗涤缓冲液（pH 7.3）。

（7）取出一些样品留待分析用，将其余的上清液上样于预柱，控制速度使其以5柱床/小时的流速流过预柱和免疫亲和层析柱。按加样上清液体积的1/100～1/10分步收集穿透液。(www.xing528.com)

（8）加入5倍体积的洗涤缓冲液，然后关闭两根柱子的阀门，断开亲和柱与预柱之间的连接，放开亲和柱阀门，直至柱床上面的液体液面降至柱床表面。

（9）依次用下列落液洗柱分别收集流出组分：

①5倍体积的磷酸盐洗涤缓冲液（pH7.3）。

②5倍体积的Tris缓冲液（pH 8.0）。

③5倍体积的Tis缓冲液（pH 9.0）。

（10）以5倍体积的三乙醇胺溶液洗脱。为中和洗脱液，将每个柱床流出的洗脱液收集于0.2体积的pH 6.7 1mol/L Tris-HCl缓冲液中。

（11）用5倍体积的TSA溶液洗柱子。

（12）最后分析洗脱液成分，每份洗脱液均取50μl以SDS-PAGE银染分析。取0.5～1mL上柱样品和有代表性的穿透流出液及洗脱液以Ab-Sepharose免疫共沉淀，并进行SDS-PAGE和银染检测以了解柱子是否饱和。

（四）注意事项

（1）层析介质的选择。亲和层析的介质要求与凝胶层析的介质要求类似：非特异性吸附要低以减低，与其他大分子的作用；具有很好的液体流动性；在一定范围的pH、离子强度和变性剂浓度中具有化学和物理稳定性；具有合适的较多的化学基团，以利于配体以共价键与其牢固连接并保持稳定；具有非常接近的多孔性。琼脂糖凝胶（sepharose）或交联琼脂糖凝胶（Sepharose CL-4B CL 6B）是目前理想的固相载体。

（2）配体的选择。用来制备层析介质的配体与需提纯的蛋白质之间必须有较强的亲和力，解离常数最好在5mmol/L以下；但亲和力太高也不适用作亲和层析，必须具有一些可与介质形成共价结合的化学基团，但不影响配体与蛋白质的结合。

（3）配体与介质的结合。配体与介质的结合是亲和层析的关键，结合的方法主要有四类，即载体结合法、物理吸附法、交联法和包埋法。一般步骤是首先活化支持物上的功能基团，然后将选定的配体连接到已活化的基团上。为防止配体和支持物被破坏，结合的化学条件必须足够温和。结合完成后，须尽可能除去未交联的配体，并测定交联的配体量。在亲和层析中，支持物Sepharose CL-4B最常使用。使支持物活化时，需在pH11的环境下，对支持物用溴化氢进行处理。加入的溴化氢浓度越高则取代率越高。最后，运用常规的有机合成操作法将配体与取代后的支持物结合。

由于高浓度的小配基能够封闭载体上的某些活化位点，因此，会使配基的结合率降低；大的配基同样地能够封闭相邻的活化位点，也造成低结合率。根据实践，每毫升10mg配基凝胶较为理想。为避免对凝胶载体的破坏，操作中忌用磁力搅拌器激烈混合配基与凝胶载体。室温下，耦联过程常需要2～4小时。4℃下需16小时左右。使用与凝胶有相反电荷或可共价连接的试剂时，溶液的pH必须在一个适当的范围内，室温下操作只能进行2～4小时。最后用5～10倍柱床体积的初始缓冲液充分洗涤封闭剂。

（4）层析条件。蛋白质混合物通过亲和层析柱前，柱中配体浓度已知且恒定，而大分子物质的浓度为零。当样品流过介质时，配体与目标蛋白质发生作用，形成复合物，即目标蛋白+配体=蛋白质-配体复合物。这种复合物也可解离。随着样品的不断加入，反应向右移，蛋白质-配体复合物形成不断增多，在柱中形成一个明显的紧密吸附带。

为要把已结合的目标蛋白洗脱，通常要用较为强烈的条件。一种是用含有较高亲和力能与配体竞争的物质洗脱，但其洗脱效率决定于复合物的解离速度。通常需要用大量的洗脱液才能增加蛋白质的洗脱。另一种是通过强烈改变复合物所处的环境条件使其解离，常改变的条件是洗脱液的PH、离子强度、温度。