柱层析：凝胶过滤层析实践

（一）基本原理

凝胶过滤层析是一项重要的蛋白质纯化技术，也叫分子筛层析凝胶渗透层析、排阻层析和大小排阻层析等。它主要是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，并根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。这种方法利用分级分离，不需要蛋白质的化学结合，可明显降低因不可逆结合所致的蛋白质损失和失活。此外，可利用此法更换蛋白质的缓冲液或降低缓冲液的离子强度。凝胶层析的支持物是多孔的凝胶。当不同分子流经凝胶层析柱时，每个分子不仅是向下移动，而且还在做无定向的扩散运动。分子直径比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶颗粒的微孔，只能经过凝胶颗粒之间的孔隙，这样的分子是随溶剂一起移动的，因而最先流出柱外；而分子直径比凝胶孔径小的分子，则能够进入凝胶颗粒的微孔之中，即进入凝胶相内。当分子在凝胶相的时候，它就不能和洗脱液一起向前移动，结果使小分子向下移动的速度要落后于大分子，最后流出柱外。

（二）材　料

（1）仪器设备。凝胶过滤层析需要与收集器相连的一根柱，一个向层析柱加缓冲液的自动存储器，一台通过加压调节缓冲液流速的蠕动泵，一台紫外检测器和记录仪。

（2）凝胶过滤层析介质。葡聚糖凝胶（sephadex）是以葡聚糖为基本骨架、含大量羟基的亲水凝胶，它不溶于弱酸、碱、盐、有机溶剂及水，但在强酸中，凝胶的糖苷键易被水解。聚丙烯酰胺基葡聚糖（sephacryl）是由丙烯基葡聚糖与N，N'-亚甲基双丙烯酰胺共价交联制备的刚性凝胶，在所有溶剂中都不溶解，能适应较高的流速，回收率也较高，因此，被广泛应用于蛋白质的分离。交联琼脂糖凝胶（Sepharose）CL-6B的化学物理稳定性比琼脂糖好，并有较好的刚性，可被高压消毒，也可耐受变性剂。其网孔较大，适用于大分子蛋白质、DNA、RNA及病毒的分离。

（3）PBS缓冲液（pH 8.0）。

（三）操作步骤

（1）柱的平衡。用PBS（pH 8.0）以50cm/h的线性流速平衡层析柱5个柱体积。

（2）上样。关闭层析柱下口，吸除凝胶表面液体，将样品加到凝胶柱床上层，开放下口，待样品全部进入凝胶柱床后，用PBS存满凝胶柱床上层空间，并将层析柱连入层析系统。

（3）样品分离。用PBS（pH 8.0）以10cm/h的线性流速缓慢洗脱两个柱体积。分别收集紫外检测仪在特定波长（如260nm）所检测到的不同的吸收峰。(www.xing528.com)

（4）样品检测。用SDS-PAGE判断分离样品的分子质量和纯度，用相应的活性和抗原检测手段判断样品中目标蛋白的含量。

（四）注意事项

凝胶过滤层析有如下优点：①根据分子质量大小进行蛋白质的纯化；②可测定蛋白质的分子质量；③可研究蛋白质二聚体或寡聚体的存在；④蛋白质纯化过程中或纯化后的脱盐，与透析法相比，凝胶过滤层析除盐速度快，不影响生物大分子的活性。

（1）柱体尺寸：分级分离时，宜选用长柱；组别分离宜选用短柱，可在短于50cm的柱体中选择。

（2）对于Sephadex软胶来说，系统反压的保持十分重要，可用恒流泵控制。Sephacryl，Sephararose CL的操作压可提高。

（3）装柱中切忌出现气泡。操作中对凝胶悬波抽气，保持柱体温度与缓冲液温度的一致性，均是避免气泡出现的措施。

（4）凝胶过滤层析的上样体积切不可超过柱体积的1%～5% ，同样，样品中的浓度一般不超过4%，样品本身对洗脱液的相对黏度不得超过2%。

（5）凝胶过滤层析的分辨能力受限于凝胶介质本身，但如下的操作：①降低流速；②选用小直径，即超细凝胶；③选取狭分级范围的介质材料等办法可提高分辨能力。